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摘要目的：探讨lncRNAGm2115对糖尿病肾病骨髓间充质干细胞迁移的影响以及潜在的机制。<br>　　方法：运用二代测序技术(RNA sequencing，RNA-seq)检测正常小鼠及糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)模型小鼠肾脏组织中差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR， qRT-PCR)检测候选lncRNA在DN模型小鼠及对照小鼠肾脏组织中的表达情况。我们采用C57BL/6J雄性小鼠提取股骨和胫骨的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)进行原代培养，通过流式细胞仪检测BMSCs表面标志物、成骨成脂诱导实验对第三代BMSCs进行鉴定。对BMSCs进行DN样微环境(高糖、高脂多糖、高糖基末期终产物)培养，构建DNBMSCs模型，运用划痕实验检测DNBMSCs和正常BMSCs的迁移能力。通过qRT-PCR检测候选DN相关的lncRNA，仅lncRNAGm2115的差异表达趋势与肾脏组织RNA-seq和qRT-PCR结果一致，因此选择lncRNAGm2115作为课题的研究对象。通过qRT-PCR和荧光原位杂交(fl uorescent in situ hybridization，FISH)检测lncRNAGm2115在BMSCs细胞核和细胞质中的表达分布情况。运用ORFfinder预测lncRNAGm2115可能的开放阅读框(open reading frame，ORF)，对最可能编码的ORF后添加Flag构建过表达载体并转染至工具细胞中，westernblot检测Flag标签表达情况以确定lncRNAGm2115编码能力。构建lncRNAGm2115过表达慢病毒载体，确定BMSCs最适MOI感染值，设计合成lncRNAGm2115小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，并运用qRT-PCR验证过表达及敲低效应。通过划痕实验、Transwell小室迁移实验检测过表达及敲低lncRNAGm2115后BMSCs迁移能力变化。Westernblot检测过表达及敲低lncRNAGm2115后BMSCs迁移因子P21活化激酶1(p21-activated kinase 1, PAK1)及基质金属蛋白酶9(matrix metal loproteinases 9, MMP9)的表达情况。为了进一步探讨lncRNAGm2115调控BMSCs迁移的潜在机制，利用在线预测软件Dianatools预测lncRNAGm2115潜在的miRNA靶基因，进一步通过软件RNAV22检测潜在的miRNA靶基因与lncRNAGm2115的结合位点及结合能情况。通过双荧光素酶实验验证lncRNAGm2115与miR-29b-1-5p的结合情况。运用qRT-PCR检测miR-29b-1-5p在正常及DNBMSCS中的表达，进一步，在BMSCs中过表达或敲低lncRNAGm2115，运用qRT-PCR检测miR-29b-1-5p的变化。为了进一步研究miR-29b-1-5p对BMSCs迁移能力的影响，我们体外设计合成miR-29b-1-5pmimics与inhibitor，并转染到BMSCs中，通过qRT-PCR检测其转染效率，以及高低表达miR-29b-1-5p后lncRNAGm2115后的表达情况。并且，通过划痕实验、Transwell小室迁移实验检测高低表达miR-29b-1-5p后BMSCs迁移能力变化。通过westernblot检测高低表达miR-29b-1-5p后BMSCs迁移因子PAK1及MMP9的表达情况。通过miRTarBase数据库检测miR-29b-1-5p的靶基因，MatInspector7.2检测启动子结合位点，寻找靶基因与BMSCs迁移相关的信号途径。运用westernblot检测高低表达miR-29b-1-5p后Akt1及p-Akt1表达。通过westernblot检测正常BMSCs中过表达lncRNAGm2115并高表达miR-29b-1-5p及DNBMSCs中敲低lncRNAGm2115并低表达miR-29b-1-5p后BMSCs迁移因子PAK1及MMP9的表达情况。<br>　　结果：LncRNAGm2115在DN小鼠肾脏组织和DN微环境培养的BMSCs中的表达相比正常小鼠肾脏组织和正常培养的BMSCs中的表达均为显著上调，提示lncRNAGm2115可能是一个参与调控DNBMSCs生物学行为的重要因子。运用流式细胞术检测培养至第三代的BMSCs表面标志物CD29、CD45的表达，结果显示BMSCs高表达CD29，阳性表达率为99.91%；CD45呈低表达，表达率为7.71%，并且可分化为脂肪样、骨样细胞，以上结果表明BMSCs模型构建成功，可用于后续实验。划痕实验检测DN微环境培养的BMSCs和正常BMSCs迁移能力结果显示DNBMSCs迁移能力显著下降，并且培养48h后迁移能力下降最为明显。FISH及qRT-PCR实验结果表明lncRNAGm2115在BMSCs细胞核及细胞质内均有分布，主要位于BMSCs细胞质中。ORFFinder分析lncRNAGm2115编码蛋白能力，在最可能编码的ORF1后添加Flag标签并转染至工具细胞中，westernblot结果表明Flag标签处无蛋白表达，说明lncRNAGm2115不具有编码蛋白能力；在正常BMSCs中转染lncRNAGm2115过表达慢病毒载体，荧光显微镜下观察BMSCs最适MOI值为75，qRT-PCR结果显示它具有良好的过表达效应。在DN微环境培养的BMSCs转染lncRNAGm2115的siRNAs，qRT-PCR检测其敲低效应，结果显示siGm2115.1、siGm2115.2、siGm2115.3均有敲低效应，但siGm2115.1和siGm2115.3敲低效应最优，因此作为后续实验工具。划痕实验及Transwell小室迁移实验结果提示lncRNAGm2115在DN微环境培养的BMSCs中抑制BMSCs的迁移能力。Westernblot实验结果表明，敲低lncRNAGm2115能上调DNBMSCs迁移因子PAK1、MMP9的表达。进一步生物信息学预测提示lncRNAGm2115与miR-29b-1-5p存在结合位点，双荧光素酶实验结果证实lncRNAGm2115和miR-29b-1-5p有结合关系，qRT-PCR结果表明过表达lncRNAGm2115后miR-29b-1-5p表达受到抑制，而敲低lncRNAGm2115可促进miR-29b-1-5p表达；上调miR-29b-1-5p表达后lncRNAGm2115表达受到抑制，而下调miR-29b-1-5p表达后lncRNAGm2115表达受到抑制，提示lncRNAGm2115和miR-29b-1-5p存在负反馈作用，可能共同参与调节DNBMSCs迁移。划痕实验及Transwell小室迁移实验结果提示miR-29b-1-5p在DN微环境培养的BMSCs中能促进BMSCs的迁移能力。Westernblot实验结果表明，上调miR-29b-1-5p表达能显著上调DNBMSCs迁移因子PAK1、MMP9的表达。通过miRTarBase数据库及RNAv22软件发现miR-29b-1-5p与胶质瘤相关癌基因同源物1(Glioma-associated oncogene homolog 1，Gli1)结合能最高，文献报道Gli1可调控BMSCs迁移相关信号途径中Akt1的表达，MatInspector7.2证实Gli1与Akt1启动子存在结合位点。Westernblot实验结果表明，上调miR-29b-1-5p后促进DNBMSCs中Akt1磷酸化。进一步westernblot实验结果证实lncRNAGm2115可能通过miR-29b-1-5p/Gli1/Akt1通路影响DNBMSCs迁移发挥作用。<br>　　结论：在DN小鼠肾脏组织和DN微环境培养的BMSCs中，lncRNAGm2115显著高表达，并且lncRNAGm2115对DNBMSCs迁移有抑制作用，而lncRNAGm2115靶基因miR-29b-1-5p对DNBMSCs迁移有促进作用，miR-29b-1-5p可能通过靶基因Gli1调控BMSCs迁移相关Akt1信号途径，从而在BMSCs迁移中发挥作用，并且lncRNAGm2115可能通过miR-29b-1-5p/Gli1/Akt1通路对DNBMSCs迁移发挥作用。它们可作为促进DNBMSCs迁移新分子靶标，为防治DN提供新思路。