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摘要第一部分差异甲基化CpG-SNP在中国汉族人群中的白塞氏病及小柳原田综合征的易感性研究<br>　　背景：<br>　　葡萄膜炎是累及虹膜、睫状体、脉络膜等部位的炎症性眼病的总称，能导致视功能严重损害。白塞病(Behcet'SDisease，BD)和小柳原田(Vogt-Koyanagi Harada，VKH)综合征是我国葡萄膜炎中最重要的致盲类型，病因和发病机制尚不完全清楚，通常被认为是一种免疫相关的复杂性疾病，遗传和环境等易感因素可能参与疾病的发生发展过程。由于表观遗传修饰可受环境的影响，从而影响基因的表达。DNA甲基化是表观遗传学的关键部分，为基因组区域的调控提供了高度互补的数据。表观遗传修饰可促使遗传易感个体发展出紊乱的免疫特性导致免疫相关疾病,因此，在BD及VKH综合征的遗传易感性研究中考虑表观遗传因素至关重要。通过结合BD及VKH综合征基因的甲基化及遗传变异SNP，分析二者的共同调控关系以期探索疾病的致病机理。<br>　　目的：<br>　　我们实验前期对BD以及VKH综合征进行了全基因组表观遗传关联研究(Epigenome-Wide Association Studies，EWAS)，并发现了相关差异的甲基化CpG位点。在本研究中，我们研究这些位点是否存在遗传多态性，以及这些多态性的频率在BD及VKH综合征中是否发生了改变。<br>　　方法：<br>　　在BD的研究中，我们进行了两个阶段的研究。第一阶段纳入了358名BD患者和704名健康对照，使用iPLEXGold分析法研究了10个筛选的CpG-SNP的遗传变异(rs10454134，rs176249，rs3808620，rs10176517，rs11247118，rs78016579，rs9461624，rs10492166，rs34929465和rs6507921)。在第二阶段中，另外纳入172名BD患者和330名健康个体用于验证在第一阶段中发现的趋势。<br>　　在VKH综合征的研究中，对1074例VKH综合征患者和1543例健康对照者进行了两阶段的病例对照研究。使用iPLEXGold基因分型分析和SequenomMassARRAY对EWAS筛选的8个CpG-SNP的遗传变异位点(rs28383361，rs1064715，rs12291891，rs2523894，rs2233327， rs28362680，rs7258606，rs1042920)进行了分型分析。随后应用分子动力学对潜在功能位点进行蛋白结构预测。<br>　　结果：<br>　　在BD的研究结果中发现，在第一阶段中，BD患者与对照相比，发现了CpG-SNPrs10454134有较高的AG基因型频率(p=0.008，OR=1.413，95％CI=1.094-1.826)和较低的GG基因型频率(p=0.003，OR=0.630，95％CI=0.465-0.854)。但在进行多重校正后，在第一阶段所发现的关联都失去了统计学意义。其他CpG-SNP在BD患者与对照组之间无差异。第二阶段以确认CpG-SNPrs10454134趋势，仍未在此CpG-SNP与BD之间发现相关性。<br>　　VKH综合征患者的CpG-SNPrs28362680的AA、GA基因型和A等位基因的频率显著增加(P=2.40E-10，Pc=5.76E-09，OR=2.368，95％CI=1.802-3.111；P=5.72E-18，Pc=1.37E-16，OR=2.006，95％CI=1.712-2.352；P=4.19E-34，Pc=1.01E-32，OR=2.093，95％CI=1.857-2.360)和在VKH综合征患者中发现了显著降低的GG基因型频率(P=4.52E-34，Pc=1.09E-32，OR=0.371，95％CI=0.316-0.436)。但rs28362680对VKH的影响可能是由于与DRB1基因变异位点的连锁不平衡导致的，故不排除其只产生了次要影响。排除了无法测定的两个CpG-SNP(rs1064715和rs2233327)和偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)的三个CpG-SNP(rs28383361、rs12291891和rs1042920)。其他CpG-SNP(rs2523894和rs7258606)未显示任何关联。根据临床表现进行的分层分析未显示任何关联。对位于BTNL2上的CpG-SNPrs28362680进行蛋白结构预测发现该位点能引起BTNL2蛋白结构改变。<br>　　结论：<br>　　在BD的研究中，未能发现筛选的异常甲基化CpG-SNP与BD之间有关联。<br>　　基于VKH综合征关联甲基化位点，我们发现位于差异甲基化位点cg18584440中的CpG-SNPrs28362680与VKH综合征的易感性相关。由于rs28362680与DRB1基因变异位点的存在连锁不平衡，故不排除其对VKH综合征只产生了次要影响。Rs28362680能引起BTNL2蛋白结构改变，说明该位点可能导致BTNL2的功能变异。<br>　　第二部分BTNL2基因启动子区DNA甲基化水平在小柳原田综合征患者树突状细胞中的研究<br>　　背景<br>　　小柳原田(Vogt-Koyanagi Harada，VKH)综合征是葡萄膜炎中常见类型之一。VKH综合征是由CD4+T细胞介导一种自身免疫性炎症疾病。BTNL2是嗜乳脂样蛋白成员之一，有报道BTNL2可结合表达在T细胞上的受体从而抑制T细胞增殖和细胞因子的产生。树突状细胞(dendritic cells，DC)作为最强的抗原提呈细胞，在自身免疫反应的启动和进展中发挥了关键作用，且BTNL2主要在DC中表达。DNA甲基化能通过调控染色质结构和转录因子的结合来调节基因表达。在此前我们实验室的研究发现，在VKH综合征患者中，IRF8、GATA3、Foxp3等多个基因的表达与启动子高甲基化相关。此前关于BTNL2基因启动子甲基化的研究尚未报道，于是本部分课题首次探索性的提出假设：甲基化调节DC中的BTNL2表达从而调节T细胞免疫反应参与疾病病理过程。<br>　　目的：<br>　　在本研究中，我们探讨DC中BTNL2基因启动子区甲基化是否参与了VKH综合征的发生发展过程。<br>　　方法：<br>　　利用荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测VKH综合征患者和健康对照的DC中的BTNL2mRNA表达水平。应用流式技术检测BTNL2在VKH综合征患者和健康对照的DC中的蛋白表达水平。利用SequenomMassARRAY系统检测VKH综合征患者和健康对照DC的BTNL2基因启动子区DNA甲基化水平。<br>　　结果：<br>　　结果发现活动期VKH综合征患者DC中BTNL2mRNA及蛋白水平均显著降低且在活动期VKH综合征患者中BTNL2基因启动子CG位点相比较于正常人表现出较高的甲基化水平。用药后的静止期VKH综合征患者的BTNL2的mRNA及蛋白表达水平升高，且BTNL2基因启动子CG位点的甲基化水平在静止期患者中要低于活动期患者。<br>　　结论：<br>　　1.BTNL2基因启动子甲基化可能参与了VKH综合征的病理过程。2.BTNL2在活动期VKH综合征患者中的低表达可能于BTNL2启动子甲基化水平的升高有关，即BTNL2启动子甲基化可能调控了BTNL2的表达。3.环抱素和激素可能通过降低VKH综合征患者DC中BTNL2甲基化水平，上调其表达水平，从而达到负性调控的作用。