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摘要目的：结肠癌是世界上第三常见的恶性肿瘤，死亡率居第四位。我国每年有18万人死于结肠癌，给人民的健康带来严重威胁。转移是导致结肠癌患者死亡的主要原因，进一步研究结肠癌的转移机制对于改善患者的预后具有重要意义。既往研究发现赖氨酸特异性去甲基化酶1（Lysine-specific demethylase1，LSD1）及其相互作用蛋白在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。为深入了解LSD1相互作用蛋白在结肠癌中的作用，本文通过结肠癌组织、结肠癌细胞及裸鼠来研究LSD1相互作用蛋白X线修复交叉互补蛋白5（X-ray repair cross complementary protein5，XRCC5&Ku80）与叉头蛋白转录因子2（Forkhead-Related Transcription Factor2，FOXF2）在结肠癌中的作用及分子机制。<br>　　方法：1、通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白免疫印迹（western blot）检测LSD1、Ku80在所纳入的结肠癌细胞LOVO、SW480、HT-29、HCT116中的表达情况，免疫沉淀联合质谱筛选鉴定LSD1相互作用蛋白，通过在线数据库可视化与LSD1相互作用蛋白之间的网络关系、分子功能及所参与的通路，采用免疫荧光实验、免疫沉淀、western blot检测Ku80与LSD1的细胞定位及相互作用。2、利用qRT-PCR、western blot方法分别检测LSD1、Ku80、FOXF2在4株不同侵袭迁移能力的结肠癌细胞中mRNA、蛋白表达水平，分析三者之间的相关性及与结肠癌细胞侵袭迁移能力的相关性。3、采用免疫组化技术检测Ku80、FOXF2蛋白在结肠癌组织中的表达，并分析其与结肠癌临床病理特征之间的关系。同时通过生物信息学分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库结肠癌数据集中Ku80、LSD1、FOXF2的表达及三者之间的表达相关性。4、采用shRNA干扰HCT116细胞中Ku80的表达，单胺氧化酶抑制剂RN-1抑制LSD1活性，western blot检测FOXF2的表达水平，染色质免疫沉淀联合PCR（CHIP-PCR）验证Ku80结合FOXF2基因启动子区域的序列，及启动子区H3K4的甲基化水平，通过Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，流式细胞仪检测细胞凋亡，MTT、EDU检测细胞增殖，细胞克隆形实验及裸鼠成瘤实验观察细胞成瘤能力。在HCT116细胞中利用shRNA干扰技术干扰Ku80的表达，Western bolt检测wnt/β-catenin通路下游靶基因LGR5、AXIN2、MYC、CD44的表达清况。<br>　　结果：1、LSD1、Ku80在4株结肠癌细胞中均有表达，且表达与LSD1的表达呈正相关；免疫沉淀联合质谱筛选并鉴定与LSD1相互作用的蛋白364个，利用在线数据库可视化LSD1的相互作用蛋白互作网络及它们在细胞内代谢过程、参与的通路及分子功能。其中Ku80是LSD1的相互作用蛋白之一。进一步免疫荧光检测发现Ku80与LSD1表达主要定位于细胞核。IP联合western blot检测证明了Ku80与LSD1存在相互作用。2、在所纳入的4株结肠癌细胞中，HCT116细胞中Ku80的蛋白、mRNA表达水平最高；相反，FOXF2蛋白、mRNA表达水平最低；相关性分析发现Ku80与FOXF2蛋白及mRNA水平成负相关；所纳入的4株结肠癌细胞中，HCT116细胞侵袭迁移能力最强，直线相关性分析显示Ku80的蛋白水平及mRNA水平与结肠癌细胞的侵袭、迁移能力成正相关，而FOXF2蛋白及mRNA水平与结肠癌细胞的侵袭迁移能力呈负相关。3、Ku80、FOXF2在结肠癌组织及正常对照结肠组织中均有不同程度表达，发现Ku80为细胞核染色，FOXF2蛋白为细胞质染色；在108例结肠癌样本中，76.93%的病例Ku80呈高表达，而在对照组中，58.33%的正常结肠组织呈高表达状态。Ku80在不同TNM分期（Ⅲ/Ⅳ与Ⅰ/Ⅱ比较）、是否有淋巴结转移之间的差异有统计学意义。而FOXF2在108例结肠癌样本中，72.22%的病例呈低表达状态，而在对照组中，66.67%的正常结肠组织呈高表达状态。进一步分析发现在不同TNM分期（Ⅰ/Ⅱ与Ⅲ/Ⅳ比较）、是否有淋巴结转移之间具有差异。生物信息学分析LSD1，Ku80、FOXF2的表达情况，泛癌分析发现LSD1、Ku80在多种肿瘤中高表达，而FOXF2呈低表达。LSD1与Ku80在原发肿瘤中的转录较正常对照组显著增高，而FOXF2较正常对照组则显著降低。Ku80与LSD1在结肠癌数据集中的表达呈正相关，而二者与FOXF2的表达呈负相关。4、采用RNAi技术成功敲低了结肠癌细胞HCT116中Ku80的表达。敲低Ku80、抑制LSD1活性均能使结肠癌细胞HCT116侵袭迁移、增殖及克隆形成能力减弱，且诱导结肠癌细胞调亡；裸鼠皮下异体成瘤能力明显受到抑制，且使用LSD1抑制剂联合敲低Ku80的表达对上述表型抑制效果更显著；western blot检测发现干扰Ku80表达、抑制LSD1活性或联合应用，可使FOXF2蛋白表达上调；通过CHIP-PCR实验发现LSD1与Ku80相互作用并结合在FOXF2基因的启动子区域687-887bp部位，并上调启动子区H3K4me2的甲基化水平从而促进FOXF2基因转录激活，经Wnt/β-catenin信号通路下调下游靶基因LGR5、AXIN2、CD44、MYC的表达抑制结肠癌细胞的恶性表型。<br>　　结论：1.Ku80、LSD1在结肠癌细胞内存在相互作用，二者主要表达部位位于细胞核，且表达水平呈正相关。2.Ku80的表达水平与结肠癌细胞的侵袭迁移能力正相关，而FOXF2的表达水平与结肠癌细胞的侵袭迁移能力呈负相关。3.在较晚TNM分期（Ⅲ、Ⅳ期）及淋巴结转移的结肠癌组织中Ku80呈高表达，而FOXF2呈显著低表达状态，与结肠癌的TNM分期、有无淋巴结转移相关。4.Ku80与LSD1相互作用并结合在FOXF2基因的启动子区域687-887bp部位；敲低Ku80联合抑制LSD1可具有更好的抑制结肠癌细胞侵袭、迁移、增殖及异体成瘤能力，并诱导其调亡。其机制为显著上调FOXF2启动子区H3K4me2的甲基化水平促进FOXF2基因的转录激活，并经Wnt/β-catenin信号通路下调下游靶基因LGR5、AXIN2、CD44、MYC的表达从而抑制结肠癌细胞的恶性表型。