检索历史 清除

摘要目的：<br>　　前期有研究表明，Slc26a9基因的缺失会损害壁细胞的功能和生存，并且SLC26A9基因的下调导致了胃癌的发生发展。慢性萎缩性胃炎作为胃癌发生的更早事件，明确其发生及恶性转化机制，对胃癌早期诊断与及时干预具有特殊的迫切性与重要的科学价值。本课题旨在通过胃组织特异性Slc26a9敲除小鼠明确Slc26a9基因在慢性萎缩性胃炎发生发展中的重要作用，以及SLC26A9与慢性萎缩性胃炎病人的临床相关性。<br>　　方法：<br>　　1）运用qRT-PCR和IHC技术分别检测正常人胃黏膜及慢性萎缩性胃炎患者胃黏膜SLC26A9表达情况；<br>　　2）委托广州赛业生物有限公司制备胃组织特异性Slc26a9敲除小鼠；运用PCR扩增技术、WB技术检测小鼠胃中Slc26a9敲除情况；<br>　　3）自小鼠出生后1月起，每月测量Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠体重，计算小鼠生存率并绘制曲线；<br>　　4）运用H&E染色技术观察了Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠自出生后8天到18个月的胃组织形态学；<br>　　5）基因芯片分析小鼠胃黏膜细胞及化生标志物表达，运用免疫组织化学技术鉴定6月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜萎缩及化生的分子标志物；<br>　　6）基因芯片分析小鼠胃黏膜分化及胃干细胞标志物表达，运用qRT-PCR技术检测Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜炎症因子IL-1β，IL-6，IL-11，IL-17和IL-33的mRNA表达；运用原位杂交技术及免疫组织化学技术鉴定出生后1月到14月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃干细胞标志物Lrig1，Lgr5和Mist1的表达；<br>　　7）基因芯片分析小鼠胃黏膜紧密连接相关基因表达，运用免疫组织化学技术鉴定6月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜屏障相关标志物Claudin18.2，Muc5ac以及EMT相关标志物E-cadherin，ZO-1和Vimentin的表达；8）运用Ki67和TUNNEL染色技术检测6月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜增殖和凋亡情况；运用WB技术检测凋亡相关蛋白Cyt-C，Endo G和AIF的表达情况；透射电镜观察6月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜线粒体结构。<br>　　9）根据筛选出的差异基因，进行Pathway富集分析通路变化情况，分析TGF-β信号通路相关基因表达，运用免疫组织化学技术检测TGF-β信号通路蛋白TGF-β，p-smad2和p-smad3在6月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜中的表达；<br>　　10）运用免疫组织化学技术鉴定14月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜EMT相关蛋白E-cadherin，ZO-1,Vimentin和Snail的表达情况，鉴定1月到14月龄Slc26a9fl/fl和Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠肿瘤干细胞标志物CD44的表达；<br>　　结果：<br>　　1）与正常人相比，慢性萎缩性胃炎患者胃黏膜SLC26A9基因表达明显减低；<br>　　2）成功制备并鉴定壁细胞组织特异性Slc26a9敲除小鼠；<br>　　3）Slc26a9基因缺失对小鼠生长及生存无影响；<br>　　4）Slc26a9基因缺失导致小鼠自发性慢性萎缩性胃炎，肠化生以及胃恶性病变的发生；<br>　　5）Slc26a9基因缺失导致小鼠胃黏膜上皮细胞分化标志物表达减低以及性慢性萎缩性胃炎和肠化生的分子标记鉴定；<br>　　6）Slc26a9基因缺失导致小鼠胃黏膜干细胞标志物表达下调，炎症因子IL-1β，IL-6，IL-11和IL-17的mRNA表达上调，干细胞标志物Lrig1，Lgr5和Mist1表达在1月到14月龄小鼠中表达逐渐减低；<br>　　7）Slc26a9基因缺失导致小鼠胃黏膜紧密连接蛋白表达减低，上皮标志物基因表达下调而间质标志物表达上调，IHC也证实Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜发生自发性EMT；<br>　　8）Slc26a9基因缺失导致6月龄Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠过度增殖和凋亡抑制；WB检测发现凋亡相关蛋白Cyt-C,Endo G和AIF表达下调；电镜观察到壁细胞线粒体结构没有改变；<br>　　9）Slc26a9基因缺失导致小鼠多条信号通路改变，TGF-β信号通路相关基因表达改变，6月龄Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠胃黏膜TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β，p-smad2和p-smad3表达减低；<br>　　10）Slc26a9基因缺失导致14月龄小鼠Slc26a9fl/fl/Atp4b-Cre小鼠自发性EMT的发生，并且促使肿瘤干细胞标志物CD44表达逐渐升高；<br>　　结论：<br>　　Slc26a9基因缺失会导致小鼠自发性慢性萎缩性胃炎及恶性病程的发生，并且在人慢性萎缩性胃炎中表达下调；Slc26a9基因对小鼠胃黏膜上皮分化稳态维持至关重要，其缺失导致炎症环境中胃黏膜正常干细胞分化紊乱，从而导致慢性萎缩性胃炎及恶性病理进程的发生；Slc26a9基因缺失通过影响TGF-β信号通路导致胃黏膜上皮分化紊乱及增殖凋亡异常，从而导致慢性萎缩性胃炎的发生发展。