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摘要小电导钙激活钾通道（smallconductance Ca2+activated K+channels，KCa2，SK）属于非电压依赖性的钙激活钾通道家族，主要分布于神经系统和心血管系统，对Ca2+的敏感性远高于大电导钙激活钾通道（bigconductance Ca2+activated K+channels，BK），可至亚微摩尔级。Ca2+通过与SK通道羧基端钙调蛋白（calmodulin，CaM）结合激活通道，K+外流从而使细胞内钙离子稳态的变化转换成细胞膜电位变化。SK通道可分为三个亚型，SK1、SK2及SK3，其中SK2通道主要表达于心房，参与心肌细胞动作电位复极化形成，在生理和病理状态下起关键作用。敲除小鼠SK2通道可延长动作电位复极化的时程，房颤的易感性增加；过表达SK3通道可使动作电位复极化缩短，亦增加房颤发生。由此提示，SK通道可作为治疗房颤等心血管疾病的靶点，但其分子调控机制，目前所知甚少。<br>　　实验室之前结果证实小鼠心肌JP2蛋白与SK2通道有相互作用，那么JP2是否通过MORN结构域与SK2发生相互作用，以及它与SK2通道结合的具体结构域，目前尚未见报道。本研究根据文献报道及JP2和SK2的结构特点，制备SK2和JP2的不同片段质粒，采用分子生物学和细胞生物学的方法，检测二者结合的具体区域；观察JP2MORN结构域对SK2通道表面膜表达的影响及作用机制；并通过功能性实验观察JP2MORN结构域对SK2通道钾电流的影响。<br>　　第一部分 JP2蛋白与SK2通道相互作用区域的验证<br>　　材料与方法：<br>　　1.免疫共沉淀和细胞免疫荧光检测SK2和JP2的定位及相互作用：大鼠心肌组织或细胞裂解液中加入JP2或SK2抗体，用proteinA/G珠子制备免疫共沉淀复合物，分析SK2和JP2蛋白之间的相互作用。制备H9c2细胞爬片，细胞免疫荧光观察SK2和JP2蛋白在细胞中的分布。<br>　　2.构建SK2和JP2片段真核表达载体：将SK2不同片段SK2-N（1-145），SK2-M（141-390）和SK2-C（380-574）克隆至载体pIRES2-EGFP中，并在C末端插入Flag/HA标签。不同长度的JP2cDNA：JP2-N1（1-253，包含MORNⅠ结构域），JP2-N2（216-350，包含MORNⅡ结构域），JP2-C（340-696）克隆至有His标签pEGFP-C1载体中。<br>　　3.免疫共沉淀检测SK2和JP2片段相互作用：分别将SK2-N，SK2-M及SK2-C与JP2-N1，JP2-N2及JP2-C两两按1∶1比例瞬时转染HEK293细胞后提取各转染组细胞总蛋白，使用特异性标签Flag和His抗体，分析SK2片段与JP2片段是否结合。<br>　　4.GST pull-down分析：分别将GST-JP2-N1，GST-JP2-N2，GST-JP2-C及对照GST原核表达载体转化BL21菌株，IPTG诱导融合蛋白表达及纯化。将各组纯化蛋白与HEK293细胞中表达的SK2-X-HA片段蛋白孵育，谷胱甘肽洗脱液特异性洗脱后用Western blot检测复合物中HA标签表达。<br>　　结果：<br>　　1.SK2和JP2可在大鼠心肌及H9c2细胞中形成免疫沉淀复合物，并且二者在H9c2细胞中分布于细胞膜及胞浆中，有明显的共定位。提示SK2通道和JP2蛋白可能存在相互作用。<br>　　2.免疫共沉淀实验结果显示JP2-N1与SK2-C末端可直接相互作用，其余实验组及对照组均未出现免疫阳性条带。<br>　　3.GST-pulldown实验结果显示大肠杆菌BL21中表达的GST-JP2-N1融合蛋白可与HEK293细胞中表达的SK2-C末端蛋白结合，该结果提示JP2通过MORN结构域I与SK2羧基端发生相互作用。<br>　　第二部分 JP2MORN结构域Ⅰ增加细胞膜SK2通道的表达和定位<br>　　材料与方法：<br>　　1.构建SK2+JP2-N1、SK2+JP2-N1mut点突变真核表达载体：将SK2和JP2-N1的cDNA亚克隆至pIRES2-EGFP中，得到SK2+JP2-N1质粒。采用点突变技术在SK2+JP2-N1质粒中构建N101R和Y141H两个突变位点。<br>　　2.HEK293稳定转染细胞株表达筛选：分别将SK2,SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒转染HEK293细胞，G418筛选，阳性克隆出现后采用有限稀释法扩大培养，提取总细胞RNA，RT-PCR检测目的基因。<br>　　3.生物素提取细胞膜蛋白：将转染各组质粒的HEK293细胞表面生物素化，裂解细胞蛋白，生物素结合的蛋白与亲和素珠子孵育后还原洗脱蛋白复合物，W estern blot检测各组细胞的SK2通道蛋白表达。<br>　　4.敲减JP2腺病毒构建及感染：将接种于培养皿中的H9c2细胞用携带阴性对照siRNA（Ad-NC）或JP2-siRNA（Ad-siJP2）的腺病毒感染。RT-qPCR和Westernblot的方法分别测定各组感染细胞中JP2mRNA和蛋白表达，并观察JP2敲减对SK2通道总蛋白及膜蛋白表达的影响。<br>　　5.免疫共沉淀检测JP2MORN结构域I突变对其与SK2通道结合的影响。<br>　　6.电生理记录：选择稳定转染SK2和SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞作为研究对象，全细胞膜片钳记录SK2通道电流。<br>　　结果：<br>　　1.建立HEK293稳定表达SK2、SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut细胞株，提取各转染细胞组SK2通道总蛋白和膜蛋白，Western blot结果显示，与单转SK2组相比，SK2+JP2-N1组SK2通道的总蛋白没有显著变化，膜蛋白显著增加；转染SK2和SK2+JP2-N1mut两组比较，SK2总蛋白与膜蛋白均无显著差异。细胞免疫荧光实验结果显示，转染SK2的HEK293细胞，SK2通道分布于胞浆中；转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞，SK2通道的膜蛋白分布显著增加，该结果提示JP2MORN结构域I可显著增加SK2通道的膜表达和定位。<br>　　2.分别用JP2敲减siRNA及阴性对照siRNA感染H9c2细胞，提取H9c2细胞的总蛋白及膜蛋白，与阴性对照组相比，JP2敲减siRNA组SK2通道的总蛋白无明显变化，膜蛋白表达显著降低。<br>　　3.分别取表达SK2+JP2和SK2+JP2mut稳定转染HEK293细胞株，用特异性SK2和JP2抗体进行免疫共沉淀实验，结果显示JP2突变显著降低其与SK2通道之间的结合。<br>　　4.全细胞膜片钳记录不同稳转细胞组的SK2通道电流，与转染SK2质粒的HEK293细胞相比，转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞中SK2电流密度明显增加。<br>　　第三部分 JP2MORN结构域Ⅰ调控细胞膜SK2通道表达的机制<br>　　材料与方法：<br>　　1.RT-qPCR检测H9c2细胞中敲减JP2对SK2mRNA表达的影响。<br>　　2.细胞免疫荧光检测转染SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道在核内体及高尔基体中定位。<br>　　3.Western blot方法检测伯氨喹处理转染SK2+JP2-N1或SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道膜表达。<br>　　4.统计学分析：所有实验数据以均数±标准误表示，图形均使用GraphPad Prism5软件创建。以两样本均数t检验进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.在稳定表达SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞株中，SK2通道与早期核内体标记物Rab5、EEA1共定位明显，而与高尔基体标记物GM130共定位较弱。该结果提示JP2MORN结构域Ⅰ突变可能使SK2聚集于早期核内体致使其转运至细胞膜发生异常。<br>　　2.用选择性抑制SK2通道循环转运途径的伯氨喹处理表达SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞，Western blot结果显示，与DMSO组比较，伯氨喹处理组的SK2通道膜蛋白均显著降低。进一步提示JP2MORN结构域I可能通过影响逆向转运通路中的循环途径降低SK2通道膜表达。<br>　　结论：<br>　　JP2MORN结构域Ⅰ通过与SK2羧基末端的相互作用直接调节SK2通道的功能和转运。