检索历史 清除

摘要通过内吞作用细胞可将膜表面受体、信号分子以及营养物质等转运至胞内从而维持生命活动的正常运转。分子量以及形态各异的货物需经由不同的内吞途径进入细胞。网格蛋白依赖型内吞（clathrin-dependent endocytosis，CDE）是目前研究最为广泛及深入的内吞途径，而网格蛋白非依赖型内吞（clathrin-independent endocytosis，CIE）途径则因细胞类型和货物蛋白等因素的变化导致其研究进展相对缓慢且认识不统一。内吞后的货物通常被转运至具有分选功能的早期内吞体（early endosomes，EEs），其后被分选至循环或者降解途径。研究人员发现CDE途径货物蛋白在胞内通常经由囊泡运输，而一些CIE途径货物则通过管状运输载体转运。内吞以及膜转运体系的精确调控发生“故障”会导致神经以及免疫系统紊乱等重大疾病。因而探究清楚内吞的作用方式，以及揭示不同内吞途径货物在胞内分选转运的调控机制有助于更好地理解细胞生物学以及相关疾病的发病机理。<br>　　本文借助于活细胞共聚焦荧光成像技术，以拥有遗传优势及膜转运研究基础的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）为模式生物，筛选参与内吞以及内吞后分选过程中新的调控分子并探究分子间互作机制。主要研究内容与意义包括：<br>　　1.研究细胞骨架调控CDE途径内吞囊泡生成的作用机制。在酵母细胞内吞过程中，质膜的内陷及剪切离不开细胞骨架F-actin的作用，然而哺乳动物细胞中网格蛋白包被小窝（clathrin-coated pits，CCPs）的剪切更多依赖于Dynamin蛋白，F-actin在多大程度上参与剪切以及其与Dynamin的互作关系尚未明确。本文工作着眼于此，借助RNAi技术对actin结合蛋白、成核促进因子以及马达蛋白等进行筛选，发现两个可以结合actin的蛋白WIP-1（WASP/N-WASP的分子伴侣WIP在线虫中同源物）以及DBN-1（F-actin结合蛋白mAbp1同源物）功能缺失导致CDE途径货物蛋白在肠细胞基底面内吞受阻。首次发现WIP-1以不依赖于WSP-1（WASP/N-WASP同源物）而是通过WH2以及CBD结构域分别与actin以及DBN-1作用的方式参与CDE。<br>　　接下来本文鉴定出WIP-1以及DBN-1参与调控的F-actin与Dynamin在CCPs剪切过程中的协同作用关系，并揭示该过程中涉及的分子间较为新颖的互作界面。wip-1以及dyn-1突变均导致CCPs剪切受阻，WIP-1、DBN-1及DYN-1（Dynamin同源物）共定位在CCPs处，且WIP-1以及DBN-1稳定F-actin在CCPs的定位，actin的组装有助于DYN-1的上膜。相较于mAbp1通过SH3结构域募集Dynamin，本文的工作发现DBN-1借助ADF-H以及3CC结构域与F-actin的结合决定了DYN-1的上膜。<br>　　2.探究分选蛋白Sorting nexins对CIE途径货物蛋白在EEs分选过程的调控作用。在诸多CIE类型中，关于Arf6依赖的CIE途径的研究较为广泛，然而目前对该途径货物蛋白在EEs上分选和运输调控机制的了解较为有限。含有结合PI3P的phox homology（PX）结构域的Sorting nexins（SNXs）可通过诱导内吞体膜弯曲出芽进而参与多种CDE途径货物蛋白在EEs上的分选过程。本论文对在线虫体内表达的SNX蛋白家族进行筛选，首次发现Arf6依赖的CIE途径货物蛋白在snx-3突变体肠细胞中无法从EEs被转运至基底侧循环内吞体，且被错误分选至溶酶体降解。<br>　　已有较多报道显示SNX-3功能缺失导致逆向运输途径的货物蛋白被错误降解，然而目前对snx-3突变改变EEs分选机制的了解较为有限。通过考察EEs上负责调控降解途径的分子在胞内的分布变化，本文发现ESCRT组分HGRS-1（Hrs同源物）的分布特征并未受到snx-3突变的影响，然而SNX-3功能缺失导致EEA-1（EEA1同源物）更多定位在EEs上，且与CIE途径货物蛋白高度共定位。EEA-1与SNX-3存在竞争结合EEs的可能，EEA-1在snx-3突变背景下更多被募集至EEs可能扰乱了分选机制。<br>　　SNX-3以不依赖VPS复合物的方式识别Arf6依赖的CIE途径货物蛋白。VPS复合物功能缺失造成CDE途径货物蛋白错误降解，而hTAC以及DAF-4等CIE途径货物在肠细胞内的分布特征并未受到vps突变的影响。VPS-35在胞内较少与hTAC共定位，而SNX-3在野生型以及VPS-35功能缺失背景下均较好定位在hTAC管状载体上。SNX-3可能通过直接或者与其他调控蛋白作用的方式识别Arf6依赖的CIE途径货物蛋白。