基于RNA--seq技术的单眼视觉剥夺大鼠针刺响应基因的表达、鉴定及功能分析-论文-万方医学网

基于RNA--seq技术的单眼视觉剥夺大鼠针刺响应基因的表达、鉴定及功能分析

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摘要目的： 　　利用全转录组测序（RNA-seq）技术检测分析单眼视觉剥夺后视皮质区差异基因的表达，对针刺干预后视皮质特异性针刺响应基因进行筛选、鉴定和功能分析，以探讨和揭示“调气通经明目”针法干预视觉剥夺效应的分子生物学机制。 　　方法： 　　14天龄健康SPF级幼鼠72只，体重20-30g，随机分为空白组（BG）、空白捆绑组（BBG）、空白针刺组（BAG）、模型组（MG）、模型捆绑组（MBG）及针刺治疗组（AG），共6组，每组12只。模型组、模型捆绑组及针刺组幼鼠进行右眼视觉剥夺模型复制，空白针刺组和针刺治疗组于造模第3天开始针刺治疗，选取“睛明”“攒竹”“风池”“光明”四穴（单日针患侧、双日针健侧），行平补平泻针法1分钟，留针10分钟，每日治疗1次，共治疗14天。模型捆绑组、空白捆绑组每天给予相同时间的捆绑刺激。治疗结束后对各组大鼠各项指标进行检测。 　　利用图形视觉诱发电位技术（P-VEP）检测各组大鼠P100波潜时、振幅数据。在脑立体定位仪下提取视皮质组织，建立mRNA表达转录组文库，利用RNA-Seq对不同组间差异基因行对比分析；借助VEEN分析法，钓取特异性针刺响应基因，并对响应基因进行GO富集分析和功能描述；利用KEGG Pathway（代谢通路）的主要公共数据库，对针刺响应基因进行Pathway分析，筛选出视功能可塑性变化的基因调控信号通路，并预测该基因的作用靶点和生物学功能。最后，针对特异性针刺响应基因进行SYBR Green荧光定量PCR扩增验证。 　　结果： 　　（1）P-VEP的对比分析 　　MG组与BG相比，其P100波形发生显著变化，表现为潜伏期显著延长和振幅缩短（P＜0.05）。BBG、BAG与BG两两比较，其右侧眼的P-VEP波无明显改变，无显著性差异（P＞0.05）。AG组与MG相比，其右眼P100波型显著改变，波形接近正常，P100波潜时明显提前，振幅显著提高（P＜0.05）；AG组与BG相比，P100波无显著性差异（P＞0.05）。 　　（2）RNA-Seq测序质控结果 　　各样本的原始测序Reads数集中在5千万左右，碱基数目集中在80亿左右，通过质量控制筛选，最终获得有效碱基的百分比均数均大于90%。各测序样本中碱基的读长为150bp，碱基含量均等，没有发生A-T，G-C分离。各样本Reads在基因上5’→3’端的位置分布相对均匀，能够被Reads覆盖的百分比范围均落入90%~100%的区间范围，占到总基因数的70%以上。各样本中基因数、平均测序深度在参考基因组上分布均匀，无偏态分布现象，质控数据良好。 　　（3）基因表达水平检测 　　各样本中FPKM值表达总和均集中在50万左右，中位数集中在1.3，均数为23，最大极值集中在12万，各样本基因表达丰度较高、组间对称性较好，基因表达分散程度较低，但基因表达量的极值有显著不同。 　　PCA分析得出各组内样品分布相对位置比较集中；各组间样品分布在二维空间的不同区域内，不同组间样品分布区域较为离散。聚类分析结果表明，同一组间或不同组间的不同样品形成了一定程度的聚类关系。 　　（4）差异基因表达分析 　　左侧视皮质差异基因对比发现：BBG与BG差异基因数目为47个，其中上调表达26个，下调表达21个。MG和BG差异基因数目为40个，其中上调表达19个，下调表达21个。BBG和BAG差异基因数目为131个，其中上调表达46个，下调表达85个。MBG和AG差异基因数目为60个，其中上调表达28个，下调表达32个。MG和MBG差异基因数目为64个，其中上调表达35个，下调表达29个。 　　右侧视皮质差异基因对比发现：BBG与BG差异基因数目为73个，其中上调表达53个，下调表达20个。MG与BG差异基因数目为63个，其中上调表达39个，下调表达24个。BBG与BAG差异基因数目为130个，其中上调表达71个，下调表达59个。MBG和AG差异基因数目为95个，其中上调表达27个，下调表达68个。MG和MBG差异基因数目为81个，其中上调表达52个，下调表达29个。 　　（5）针刺响应基因钓取 　　钓取左侧视皮质针刺响应基因共38个，其中上调18个，下调20个。钓取右侧视皮质针刺响应基因共63个，其中上调20个，下调43个。 　　左侧针刺响应基因具有不同生物学功能分类中对应下调差异基因数目（ListHits）大于2的GO条目有5个，包括参与细胞组分的4个GO Term：分别是细胞膜（membrane）、细胞核（nucleus）、细胞质（cytoplasm）和细胞膜的组成成分（integral component of membrane）；参与分子功能的1个GO Term：为蛋白质结合（protein binding）。 　　右侧针刺响应基因具有不同生物学功能分类中对应下调差异基因数目（ListHits）大于2的GO条目有21个，包括参与生物过程的5个GO Term：分别是RNA聚合酶Ⅱ启动子的转换（transcription from RNA polymerase II promoter）、DNA模板转录负调控（negative regulation of transcription,DNA-templated）、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控（negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）与生物过程（biological_process）；参与细胞组分的10个GO Term：分别是染色质（chromatin）、细胞连接（cell junction）、神经元投射（neuron projection）、细胞核（nucleus）、细胞内结构（intracellular）、膜（membrane）、核质（nucleoplasm）、胞外体（extracellular exosome）、细胞组分（cellular_component）与细胞质（cytoplasm）；参与分子功能的4个GO Term：分别是RNA聚合酶Ⅱ启动子近端区域序列特异性DNA结合（RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding）、DNA结合（DNA binding）、蛋白质结合（protein binding）、序列特异性DNA结合（sequence-specific DNA binding）、ATP结合（ATP binding）与分子功能（molecular_function）。 　　（6）针刺响应基因的KEGG Pathway分析 　　左侧31个针刺响应基因的KEGG Pathway通路比较分析发现，响应基因参与调控的相关生物学代谢通路主要包括：NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、苯丙胺成瘾（Amphetamine addiction）、NF-kB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、PI3K-AKT信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、5-羟色胺突触（Serotonergic synapse）、钙信号途径（Calcium signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、神经活性配体受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）等。 　　右侧45条视皮质针刺响应基因的KEGG Pathway通路比较分析发现，响应基因参与调控的相关生物学代谢通路主要包括：视黄醇代谢（Retinol metabolism）、NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、MAPK信号转导通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-AKT信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、神经营养因子信号转导通路（Neurotrophin signaling pathway）、CAMP信号通路（CAMP signaling pathway）等，上述大部分针刺响应基因参与的代谢通路与视功能的调控密切相关。 　　获得上述针刺响应基因调控的所有KEGG代谢通路后，以针刺有效干预视觉剥夺的生物学效应为基础，逐一对每一个代谢通路进行了分析、比对，最终筛选出Grm2基因介导的mGluRs信号通路和Pla2g2a基因介导的Alpha-Linolenic acid metabolism信号通路可能与针刺调控视功能可塑性的生物学机制具有密切相关性。 　　（7）针刺响应基因的SYBR Green荧光定量PCR验证 　　从Grm2和Pla2g2a基因的扩增曲线中可以看出随着扩增过程的进行，扩增产物不断积累，相应的荧光信号也在不断增强，经过40个循环数后，所示CT曲线基线平稳、指数增长期、平台期较为明显，扩增效率较高。目的基因和内参基因的扩增效率基因一致。其溶解曲线平台期明显，呈现单一峰，Grm2基因和Pla2g2a基因的PCR扩增特异性较好，没有出现二聚体和非特异性扩增。 　　（8）Grm2针刺响应基因介导的mGluRs信号通路 　　Grm2基因主要参与激活不同亚型的mGluRs（代谢型谷氨酸受体），通过与不同亚型的G蛋白偶联，从而激活蛋白激酶类下游信号通路，促进CREB、NF-B等转录因子释放，从转录和翻译水平促进视神经元突触结构和功能的可塑性的改变，从而激活神经传导过程中的LTP（长时程增强）和LTD（长时程抑制）现象的产生，这可能是针刺有效干预视觉剥夺效应的调控机制之一。 　　（9）Pla2g2a针刺响应基因介导的α-Linolenic acid代谢通路 　　Pla2g2a基因可参与调控ALA（α-亚麻酸）脱氢和碳链延长变化，生成下游代谢产物，再转变为长链的DHA（二十二碳六烯酸）和EPA（二十碳五烯酸），增加视网膜、视皮质组织对DHA的转化与吸收，使其更好的参与视觉光转导和视紫红质的再生，促进视觉传导和视神经元的可塑性改变，增加视觉灵敏度，促进LTP发生，这可能是针刺有效干预视觉剥夺效应的另一调控机制。 　　结论： 　　（1）大鼠视觉发育关键期内行单眼视觉剥夺可引起同侧、对侧视皮质中相关基因异常升高或降低，表现为剥夺眼同侧差异基因表达量明显大于对侧眼。差异基因的生物学功能主要集中在对视觉信号传导的促进与抑制方面。上述基因的异常表达与调控，可能构成了弱视发病的主要分子生物学机制。 　　（2）敏感期内大鼠行视觉剥夺模型复制，捆绑刺激、针刺干预均可引起视皮质内差异基因的不同程度表达；其中针刺（“调气通经明目”针法）对特定响应基因的异常表达有明显的调节作用。相比于对侧眼，这种调节效应对剥夺眼同侧视皮质的调控作用则更为明显。 　　（3）“调气通经明目”针法治疗剥夺性弱视的分子机制可能是通过对视功能相关针刺响应基因的表达调控而实现的，如对Grm2、Pla2g2a基因介导的视功能调控通路的有效干预和调节，从而减轻视觉剥夺损害，起到改善和促进视功能的恢复的作用。