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摘要肝细胞癌（HCC）发病率逐年增加，已经成为威胁人类生命健康的重大疾病。HCC的早期诊断包括影像学（超声、CT和磁共振）和血清学检测等,由于影像学检测成本较高，血清学特异性肿瘤标志物的检测越来越受到人们的重视，其中甲胎蛋白（AFP）是当前诊断HCC最特异的标记物之一，但由于个体的差异，AFP检测会出现假阳性或假阴性的结果，因此需要寻求新的生物标志物与AFP联合诊断HCC，以提高诊断的准确性。近年，胰岛素样生长因子（IGF）家族蛋白成为HCC发展和进展中的重要因子，其中胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）在HCC病人血清中表达增高，与病人的不良预后相关，但IGFBP2在HCC中的作用机制尚不清楚。研究表明，IGFBP2可通过IGF非依赖途径介导细胞生长，蛋白的C端有Arg-Gly-Asp(RGD)结构域与整合素受体β1（Integrinβ1）相互作用，Integrinβ1的活化状态下，FAK发生磷酸化，可以介导下游信号通路的激活，如JNK通路、Rac1通路和Mek/Erk通路等，提示Integrinβ1可能作为其受体在HCC增殖中发挥作用。在HCC中，早期生长反应因子1（Egr-1）的表达与细胞的增殖密切相关，研究表明Egr-1在HCC中高表达，可以通过调控下游基因，发挥着重要的促进肿瘤生长、浸润和转移的作用。本课题拟采用HCC患者临床血清及肿瘤样本、外源重组IGFBP2（rIGFBP2）体外刺激HCC细胞株为研究对象，利用Western blot、CCK-8、Transwell、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光等实验技术，研究IGFBP2在HCC细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，并进一步探讨IGFBP2促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。该研究将为揭示HCC新的病理机制和寻找新的药物靶点提供重要依据。<br>　　目的：<br>　　1.观察IGFBP2在HCC临床患者血清以及肝脏肿瘤组织中的表达。<br>　　2.观察rIGFBP2刺激下HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，明确IGFBP2在HCC细胞中的作用。<br>　　3.观察rIGFBP2刺激下HCC细胞Integrinβ1的活化及其与p-FAK的共表达，检测p-Erk、p-AKT和Egr-1的表达，部分揭示IGFBP2促进细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。<br>　　方法：<br>　　1.收集HCC患者和健康人血清和肝脏肿瘤组织样本，利用蛋白芯片法检测HCC患者血清中IGFBP2的表达，HE染色分析HCC患者肿瘤组织与癌旁组织的病理学特征，免疫组化法及Western blot法检测HCC患者肿瘤组织及癌旁组织中IGFBP2、Integrinβ1和Egr-1蛋白的表达。<br>　　2.选用HCC细胞株HepG2细胞和HCC-LM3细胞，采用CCK-8法和Transwell法分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力，Western blot及免疫荧光法检测Integrinβ1蛋白的活化，Western blot法检测Integrinβ1、p-FAK、Egr-1、p-Erk和p-AKT的表达，免疫荧光法和Co-IP法检测Integrinβ1与p-FAK的共表达。<br>　　结果：<br>　　1.IGFBP2在HCC患者血清及肿瘤组织中表达升高<br>　　采集临床HCC患者及健康人外周血血清样本，利用蛋白芯片法检测其中IGFBP2的表达，结果表明，IGFBP2在HCC患者血清中含量高于健康人；将手术切除的HCC患者肿瘤组织进行石蜡包埋、切片，采用HE染色法观察组织病理特征，结果发现癌旁组织中肝细胞呈肝索状排列，肿瘤组织中肝细胞排列无规则并且出现炎症细胞浸润、肝细胞肥大、胞核变大以及胞浆HE染色变浅，肝组织出现假小叶。采用免疫组化法和Western blot检测HCC患者肿瘤组织及癌旁组织中IGFBP2、Integrinβ1、Egr-1和p-FAK蛋白的表达，结果显示，IGFBP2、Integrinβ1、p-FAK和Egr-1在HCC患者肿瘤组织中的表达高于癌旁组织。<br>　　2.外源rIGFBP2促进HCC细胞株增殖、迁移和侵袭<br>　　选用HCC细胞株HepG2细胞和HCC-LM3细胞，利用CCK-8检测不同浓度rIGFBP2（15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL）对HepG2细胞和HCC-LM3细胞增殖的影响，结果显示62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL浓度的rIGFBP2刺激均可显著促进细胞增殖。Transwell实验检测不同浓度rIGFBP2对HepG2细胞和HCC-LM3细胞迁移和侵袭的影响，结果表明，不同浓度rIGFBP2均可显著促进HepG2细胞和HCC-LM3细胞的迁移和侵袭。<br>　　3.rIGFBP2可活化HCC细胞中Integrinβ1，促进Integrinβ1和p-FAK的共表达，激活Erk和AKT信号通路<br>　　选用亚适浓度125ng/mL rIGFBP2刺激HepG2细胞，Western blot实验表明，胞内Integrinβ1、Egr-1、p-FAK、p-Erk和p-AKT蛋白表达从30min开始升高，4h或12h达到高峰，随后逐渐降低。用rIGFBP2刺激HCC细胞30min，利用免疫荧光法检测HepG2细胞和HCC-LM3细胞中活化的Integrinβ1表达，利用免疫荧光法和Co-IP法检测HepG2细胞中Integrinβ1和p-FAK的共表达变化，结果显示，rIGFBP2作用HepG2细胞和HCC-LM3细胞30min时，Integrinβ1活化，并且与p-FAK的共表达升高，提示rIGFBP2可活化HCC细胞中Integrinβ1，促进Integrinβ1和p-FAK的共表达，激活Erk和AKT信号通路。<br>　　结论：<br>　　1.IGFBP2在HCC患者血清中的含量大于健康人，IGFBP2、Integrinβ1及Egr-1在HCC患者的肿瘤组织中的表达大于癌旁组织。<br>　　2.外源rIGFBP2可以促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，可能与rIGFBP2活化Integrinβ1，促进Integrinβ1和p-FAK的共表达，激活Erk和AKT信号通路有关。