检索历史 清除

摘要原因不明复发性自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）是指排除了染色体异常、解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染、自身免疫性疾病等因素的复发性自然流产，其发病率约1%~5%，严重影响了育龄女性的身心健康及其家庭幸福。迄今为止，URSA发病机制尚不清楚。在过去40年间，越来越多的研究表明 URSA的发生与基因突变、蛋白质表达水平改变和代谢异常密切相关。虽然这些研究促进了人们对 URSA发病机制的了解，但是有些结论是相互矛盾的，而且个别分子表达水平异常并不能解释疾病复杂的生化过程。因此，有必要利用目前生物科技领域的最新成果-组学技术平台-来进一步从转录以及蛋白质组学水平上，全面、系统地探究 URSA的发病机制及其特异性治疗靶标，并在URSA动物模型中加以验证。<br>　　同重同位素相对与绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation， iTRAQ）是一种高通量、高精确度识别和量化多种蛋白质样品的分析技术，能观察关键分子的动态变化，目前已经越来越广泛地应用于定量蛋白质组学研究领域。生物信息学分析可以提供不同蛋白分子参与的生化过程和信号转导途径，为疾病发病机制的研究提供新的思路。<br>　　临床研究发现，夫妇间人类白细胞抗原（human leukocyte antigens，HLA）相容性程度高的 URSA患者应用同种异体淋巴细胞免疫治疗（ lymphocyte immunology therapy，LIT）可显著降低流产几率，其方法是采用丈夫或第三方外周血淋巴细胞在URSA患者孕前及孕期行免疫治疗。LIT治疗URSA患者的妊娠成功率高达90%。<br>　　URSA小鼠模型中的CBA/J和DBA/2J均是近交品系小鼠，这两品系小鼠交配具有反复流产的特点，并且流产率相对恒定。同时，此模型流产属于围着床期流产，即发生于怀孕早期的胚胎着床前后，与 URSA流产时间相近。目前国内外早已引进此模型进行 URSA的相关研究，而且动物来源比较充足、可靠、经济，能够保证较大规模、较深入的实验研究。因此利用这一模型的研究将有助于揭示URSA的发病机制和LIT治疗URSA的作用机制。<br>　　本研究首先通过蛋白质组学技术定量分析URSA患者LIT治疗前后蛋白质分子表达水平的改变，并筛选出显著差异蛋白分子。然后，通过生物信息学分析找出差异蛋白最富集的关键代谢通路，并探讨该代谢通路与 URSA反复妊娠失败的关系。最后，在URSA小鼠模型上，对关键代谢通路的差异蛋白分子进行mRNA转录水平和蛋白分子表达水平的验证研究。本研究将对阐明 URSA反复妊娠失败的发病机制有重要意义，也将为LIT治疗URSA的作用机制和疗效评价提供新靶点。<br>　　为此，本研究分为如下两个部分进行深入探究：<br>　　第一部分 补体及凝血级联途径影响URSA的血浆蛋白质组学研究<br>　　目的：发现URSA患者LIT前后异常表达的显著差异蛋白，探讨显著差异蛋白参与的生化过程和代谢通路。<br>　　方法：利用 iTRAQ技术结合高效液相色谱-串联质谱（ liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术来定量分析URSA患者LIT前后血浆的蛋白差异水平，显著差异蛋白的筛选条件是在至少3次重复数据中差异倍数>1.2和p值<0.05。然后，通过基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析显著差异蛋白参与的生化过程和关键代谢通路。<br>　　结果：iTRAQ定量分析共鉴定出97个差异蛋白，其中53个上调蛋白，44个下调蛋白。GO富集功能分析显示，显著差异蛋白分子主要参与胞外区、脂质结合和运输等生化过程。KEGG富集分析中，补体和凝血级联途径是差异蛋白最显著富集的关键代谢通路（p=0.0001），其中凝血因子V（factor5，F5）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、凝血因子XIII（factor13，F13）、补体C5（complement5， C5）、肝素辅因子II（Heparin Cofactor II，HCII）、蛋白S（protein S，PS）和蛋白C（protein C，PC）等在URSA治疗后显著上调；凝血因子X（factor10，F10）和C1抑制剂（C1 inhibitor，C1INH）等则显著下调。<br>　　结论：URSA患者于LIT前后有多个蛋白表达异常，这些蛋白参与了多个生化过程。补体及凝血级联途径是最显著富集的代谢通路，这说明LIT可能是通过调节URSA患者的补体及凝血级联途径来防止胚胎丢失。补体及凝血级联途径中的关键分子有望成为URSA早期诊断和LIT疗效评价的生物学靶标。<br>　　第二部分 补体及凝血级联途径关键分子影响URSA的动物模型验证研究<br>　　目的：建立原因不明复发性自然流产（URSA）小鼠模型，并对其进行淋巴细胞免疫治疗（LIT）。分别研究补体及凝血级联途径关键分子在LIT组和对照组孕鼠的蜕膜细胞和血浆中转录水平和蛋白水平上的表达差异，探究补体及凝血级联途径及其关键分子与URSA的关系以及LIT疗效评价的生物学标志物。<br>　　方法：建立URSA小鼠模型及实验分组：将雌性CBA/J和雄性DBA/2J小鼠按照2：1比例合笼交配。将24只CBA/J分别建立URSA小鼠模型对照组（CBA/J，12只）与LIT组（CBA/J，12只）。小鼠于晚上8点合笼，次日上午9点观察雌鼠阴道栓，检出阴栓者作为妊娠0d。在LIT组中，对♀CBA/J×♂DBA/2J中的雌鼠于孕4d进行其配鼠的淋巴细胞免疫治疗。两组于孕鼠14d解剖子宫和观察胚胎丢失率，判断LIT是否成功降低URSA小鼠的胚胎流产率。然后，通过实时荧光定量PCR（real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）技术检测LIT组和对照组CBA/J孕鼠蜕膜细胞中凝血因子F5、F10、纤维蛋白原α链（fibrinogen alpha chain，FGA）、纤维蛋白原β链FGB（fibrinogen beta chain，FGB）、纤维蛋白原γ链（fibrinogen gamma chain，FGG）、F13A1、HC II以及C5、C1INH mRNA水平。利用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测LIT组和对照组孕鼠血浆中凝血因子F5、F10、FGA、FGG、F13A1、C5和C1INH的蛋白表达水平。通过受试者操作特性曲线（receiver operating characteristic cureve，ROC）分析各指标的诊断价值，以及采用Pearson相关系数分析各指标之间的相关性。<br>　　结果：LIT组URSA小鼠的胚胎吸收率明显降低（p<0.05）。与对照组相比， LIT组的URSA孕鼠蜕膜细胞中凝血因子F5、F10、FGA、FGB、FGG、HCII、F13A1以及补体分子C5和C1INH mRNA含量均明显升高（p<0.0001）。同时，LIT组孕鼠血浆中F10、FGG、FGA、F13A1、C5、C1INH的水平显著升高（p值分别为：p=0.02、p<0.000、p=0.037、p=0.03、p=0.033、p<0.000），F5表达水平显著下降（p<0.05）。F5、F10、FGG和C1INH联合诊断的AUC面积为0.972（p=0.00086；95%CI，0.912-1.0），特异性为100%，敏感度为91.7%。Pearson相关分析结果表明，对照组C1INH和FGG、F5和FGG、F10和F5、FGG和F13不相关。LIT治疗组C1INH和FGG相关（r=0.601，p=0.039）、F5和FGG相关（r=0.650，p=0.022）、F10和F5相关（r=0.632，p=0.028）、FGG和F13相关（r=0.637，p=0.026）。<br>　　结论：（1）对URSA小鼠模型进行LIT治疗可显著降低胚胎丢失率。（2）从蛋白水平和转录水平的差异分析证实，补体及凝血级联途径参与淋巴细胞免疫治疗URSA的分子作用机制，其关键分子可当作评估LIT疗效的潜在生物学靶标。（3）本研究初步发现凝血和补体级联途径存在交互作用，并可能与URSA发病机制和LIT治疗机制相关。<br>　　综上所述，通过以上两部分研究，得出如下结论：<br>　　1．补体及凝血级联途径是URSA经LIT治疗前后最显著富集的代谢通路，说明该联合代谢通路与URSA的发病机制密切相关。<br>　　2．动物模型LIT治疗前后其转录水平和蛋白水平的改变证实补体及凝血级联途径参与了URSA的发病机制，LIT可能是通过调节URSA患者的补体及凝血级联途径来防止胚胎丢失。<br>　　3．补体及凝血级联途径中的关键分子，如F5、F10、FGG和C1INH等有望成为URSA早期诊断、LIT疗效判断以及URSA治疗预后的生物学靶标。<br>　　4．凝血和补体级联途径存在交互作用并可能参与URSA的发病机制和LIT的治疗机制。