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摘要研究目的：<br>　　（1）PLAC8在不同物种的胚胎发育中具有重要的作用，并且前期研究发现在人类早期胚胎发育的各个时期中均有PLAC8蛋白的表达，然而在人类胚胎发育过程中具体作用仍然未知，因此通过构建慢病毒PLAC8敲降载体转染临床上废弃的人类早期胚胎，探讨PLAC8对人胚胎发育的影响。进一步，在细胞水平上探讨PLAC8对人胚胎干细胞的作用机制。<br>　　（2）前期研究发现PLAC8在人类囊胚体外植入过程中也有表达，并与胚胎的植入状态相关，在植入状态良好的情况下PLAC8表达量高，反之，PLAC8表达量低。本研究则探讨PLAC8对胚胎植入过程的具体影响。<br>　　研究方法：<br>　　研究一通过创建可以转录出敲降PLAC8mRNA表达的shRNA慢病毒载体来下调PLAC8表达水平。通过转染小鼠胚胎来确定最适转染滴度。再利用确定好的最适慢病毒滴度转染临床上废弃的早期3PN胚胎，观察对其胚胎卵裂率的影响。进一步，在细胞水平上探讨PLAC8对人胚胎干细胞（hESCs）的作用机制；通过慢病毒载体感染hESCs细胞，实时荧光定量PCR（qPCR）和Western Blot（WB）检测PLAC8空载体组、敲降组转染人胚胎干细胞的效率；采用qPCR检测转染慢病毒后人胚胎干细胞增殖相关基因的相对表达情况;利用Western Blot分析细胞增殖marker蛋白的表达情况；进一步利用流式细胞仪检测敲降PLAC8对人胚胎干细胞(hESCs)凋亡的影响。<br>　　研究二本实验首先构建PLAC8RNAi的慢病毒载体；通过体外受精实验获得鼠胎，收集发育至囊胚期的的鼠胚；设置慢病毒滴度分别为1×104TU/ml，1×105TU/ml，1×106TU/ml，1×107TU/ml，1×108TU/ml转染囊胚，明确最佳感染囊胚的慢病毒滴度；最后运用小鼠胚胎子宫移植技术，把经过慢病毒转染过的囊胚移植到假孕母鼠体内，2.5天后处死观察胚胎在子宫中的植入情况。<br>　　研究结果：<br>　　研究一成功构建了PLAC8的慢病毒敲降体系；慢病毒可以成功转染鼠胚和人类早期胚胎，使用1×107TU/ml诱导PLAC8RNAi的慢病毒载体感染3PN的第2-3天胚胎，敲降组胚胎卵裂率（6.5）较阴性对照组（空载体组）显著降低（10.57±1.87）；敲降组胚胎停止发育率（86%）显著高于阴性对照组（53%）。慢病毒干扰载体成功转染人胚胎干细胞hESCs，以GAPDH为内参，阴性对照组与敲降组的PLAC8mRNA的相对表达量分别是1.00±0.06，0.41±0.06，敲降组PLAC8mRNA表达量低于阴性对照组（P<0.05）,具有统计学意义；Western blot实验结果显示：内参基因是β-actin，敲降组表达下调，进一步证明慢病毒介导干扰质粒能敲降PLAC8蛋白表达。敲降组与阴性对照组相比细胞增殖相关的基因CCND1和Ki67均下调，内参基因是GAPDH，敲降组的CCND1mRNA和ki67mRNA的相对表达量分别是0.46±0.088和0.41±0.174，具有统计学意义；同时敲降组较阴性对照组cyclinD1、PCNA蛋白下调，β-actin为内参蛋白，阴性对照组和敲降组的cyclin D1蛋白表达量分别1.32±0.18和0.78±0.11，PCNA蛋白表达量分别是1.69±0.11和1.41±0.08，经分析差异具有统计学意义。流式细胞术检测敲降组凋亡率比阴性对照组增高。<br>　　研究二成功收集经过体外受精后的囊胚；经过实验发现运用慢病毒的滴度在1×107TU/ml转染囊胚最合适；成功的把转染后的囊胚移植到小鼠的子宫内，2.5天后发现PLAC8敲降组囊胚附植率低于阴性对照组。<br>　　研究结论：<br>　　1.首次通过构建PLAC8RNAi的慢病毒载体感染人类早期发育的胚胎。<br>　　2.证实了PLAC8影响早期胚胎的发育，敲降早期胚胎的PLAC8基因的表达降低了胚胎的卵裂率。<br>　　3.细胞实验进一步验证敲降人胚胎干细胞PLAC8基因的表达，会降低细胞增殖表达并促进细胞凋亡。<br>　　4.敲降囊胚的PLAC8基因表达会导致胚胎的附植率降低。