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摘要结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤第三位。尽管接受手术、放疗和化疗等综合治疗，仍有约20%-45%的CRC患者发生局部复发或远处转移，发生转移的患者5年生存率仅为14%。因此，寻找新的治疗靶点和策略，具有重要的临床意义。<br>　　代谢异常是包括CRC在内的多种恶性肿瘤的重要特征，多种代谢产物可通过调控肿瘤相关基因的表观遗传学状态和表达来改变肿瘤细胞表型。有研究表明，侵袭及转移是由肿瘤组织中具有强大自我更新能力的一群细胞所介导的。因此，研究特殊代谢状态对CRC细胞自我更新的调控，是寻找CRC转移治疗靶点的重要方向。<br>　　乙醛脱氢酶家族18成员A1(Aldehyde dehydrogenase family 18 member A1, ALDH18A1)，又称为吡咯啉-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)是谷氨酸、鸟氨酸和脯氨酸代谢途径中的关键酶，在氨基酸代谢中扮演重要角色。既往发现，ALDH18A1通过调控脯氨酸的合成代谢来促进黑色素瘤细胞的增殖。此外，ALDH18A1在luminalB型乳腺癌中高表达，与其预后不良相关。提示，ALDH18A1可能发挥癌基因的作用。但ALDH18A1在调控CRC细胞自我更新中的作用和具体分子机制尚不清楚，有待深入探索。<br>　　本研究发现，ALDH18A1高表达是结直肠癌患者的预后不良因素。生物信息学分析和功能研究表明，ALDH18A1可以调控结直肠癌细胞的增殖能力和自我更新能力。机制研究发现，ALDH18A1可能通过转录和转录后水平调控C-myc基因表达，进而促进结直肠癌细胞的自我更新。<br>　　主要方法与结果：<br>　　1.利用基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)中结直肠癌基因表达谱数据集(GSE41258、GSE103512、GSE18105和GSE37182)，比较ALDH18A1在正常结肠组织和人结直肠癌中的表达情况。结果显示，ALDH18A1在结直肠癌组织中高表达。GSE41258数据集：与正常结肠组织(7.8581±0.0884，n=74)相比，结直肠癌患者(8.3330±0.0280，n=255)的mRNA表达显著升高(P=1.7932×10-6)；GSE103512数据集：与正常结肠组织(6.8610±0.0670，n=38)相比，结直肠癌患者(7.1918±0.0273，n=242)的mRNA表达显著升高(P=1.1126×10-5)。GSE18105数据集：与正常结肠组织(9.3357±0.1312，n=17)相比，结直肠癌患者(9.7265±0.4721，n=94)的mRNA表达显著升高(P=0.0027)。GSE37182数据集：与正常结肠组织(10.8340±0.0632，n=88)相比，结直肠癌患者(11.9396±0.0474，n=84)的mRNA表达显著升高(P=1.4858×10-29)。<br>　　2.列联表分析ALDH18A1与结直肠癌临床病理参数的相关性。GSE39582数据集结果显示，ALDH18A1与肿瘤局部淋巴结转移(pN)以及AJCC临床分期等结直肠癌临床病理参数密切相关。其中，ALDH18A1mRNA在AJCC分期较高(P=0.0036)和pN分期较高(P=0.0061)的患者中表达较高。GSE39084数据集结果显示，ALDH18A1与远处转移(pM)以及AJCC临床分期等结直肠癌临床参数密切相关。其中，ALDH18A1mRNA在AJCC分期较高(P=0.0221)和pM分期较高(P=0.0382)的患者中表达较高。<br>　　3.使用肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)和GEO数据集，通过Kaplan-Meier和Cox回归分析结直肠癌患者中ALDH18A1的预后判断意义，结果显示，ALDH18A1高表达可作为结直肠癌患者的预后不良标志。其中，TCGA数据集：ALDH18A1低表达患者的生存时间(平均生存时间为95.429±6.253月，n=293)较ALDH18A1高表达患者的生存时间(平均生存时间为70.915±8.363月，n=79)显著延长(P=0.0159)；GSE17538数据集：ALDH18A1低表达患者的生存时间(平均生存时间为97.561±6.127月，n=101)较ALDH18A1高表达患者的生存时间(平均生存时间为71.979±4.762月，n=131)显著延长(P=0.0191)；GSE17537数据集：ALDH18A1低表达患者的生存时间(平均生存时间为85.18±6.464月，n=40)较ALDH18A1高表达患者的生存时间(平均生存时间为41.997±8.099月，n=15)显著延长(P=0.0404)。进一步对上述GSE17538数据集中的结直肠癌患者的预后预测因子进行单因素生存分析和Cox生存回归分析，结果提示ALDH18A1高表达可作为结直肠癌患者OS［风险比(95%可信区间)=0.582(0.370-0.914)，P=0.0187］的独立危险因素之一。此外，GSE17536数据集结果提示ALDH18A1高表达可作为结直肠癌患者OS［风险比(95%可信区间)=0.518(0.295-0.910)，P=0.022］的独立危险因素之一。GSE29623数据集结果提示ALDH18A1高表达可作为结直肠癌患者OS［风险比(95%可信区间)=0.220(0.070-0.696)，P=0.010］的独立危险因素之一。<br>　　4.利用GSEA软件进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)，探讨GEO数据集(GSE39582、GSE103512、GSE17536、GSE39923)中ALDH18A1高表达患者(筛选标准：FDR<0.25,P<0.05)通路的富集情况，结果显示，ALDH18A1高表达与细胞周期进程和DNA复制等进程密切相关。<br>　　5.运用蛋白质印迹法(Western Blot, WB )和实时定量聚合酶链式反应(real-timequantitativePCR, RT-qPCR)检测ALDH18A1蛋白在不同结直肠癌细胞系(HT29、SW620、HCT116、SW480、LoVo、7648384)中的表达，结果显示，ALDH18A1在HT29、SW620细胞系中表达量较高，而在LoVo、7648384细胞系中表达量较低。<br>　　6.慢病毒shRNA(Short hairpin RNA)敲低结直肠癌细胞系中ALDH18A1的表达，WesternBlot、RT-qPCR实验验证敲低效率后，RT-qPCR检测自我更新基因(C-myc、CD44、CD133、ALDH1A1、Lgr5、BRCA1、FUT4、NOTCH1)的表达变化，结果显示，下调ALDH18A1的表达，可显著抑制自我更新基因的表达。SW620细胞中ALDH18A1差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=0.0071；shNCvs.shALDH18A1-2，P=0.0049；shNCvs.shALDH18A1-3，P=0.0042；C-myc差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=9.7414×10-7；shNCvs.shALDH18A1-2，P=1.3031×10-4；shNCvs.shALDH18A1-3，P=5.7802×10-6；CD44差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=4.5113×10-4；shNCvs.shALDH18A1-2，P=0.0015；shNCvs.shALDH18A1-3，P=3.7578×10-4；CD133差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=0.0017；shNCvs.shALDH18A1-2，P=0.0024；shNCvs.shALDH18A1-3，P=0.0825；ALDH1A1差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=0.3395；shNCvs.shALDH18A1-2，P=0.0107；shNCvs.shALDH18A1-3，P=0.1730；Lgr5差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=7.7830×10-4；shNCvs.shALDH18A1-2，P=1.4831×10-4；shNCvs.shALDH18A1-3，P=5.6600×10-4；BRCA1差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=0.0028；shNCvs.shALDH18A1-2，P=2.2253×10-4；shNCvs.shALDH18A1-3，P=3.6021×10-5；FUT4差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=9.3926×10-6；shNCvs.shALDH18A1-2，P=7.7002×10-5；shNCvs.shALDH18A1-3，P=9.4928×10-6；NOTCH1差异表达情况：shNCvs.shALDH18A1-1，P=6.5744×10-5；shNCvs.shALDH18A1-2，P=7.7118×10-4；shNCvs.shALDH18A1-3，P=3.6143×10-5。<br>　　7.WesternBlot、RT-qPCR实验结果显示，敲低和过表达ALDH18A1后，C-myc基因表达均出现同向变化。<br>　　8.利用TCGA和GSE41258数据集分析结直肠癌患者中ALDH18A1的表达与C-myc的表达的相关性。GSE41258数据集：ALDH18A1与C-myc的表达呈正相关(r=0.3647，P=2.9489×10-24)，TCGA数据库：ALDH18A1与C-myc的表达呈正相关(r=0.2800，P=2.100×10-6)；利用GEO数据集GSE41258进行C-myc高/低表达组的表达谱差异分析，结果显示ALDH18A1在C-myc高表达组的表达水平较高(P=0.0213)；利用GSEA富集分析探讨ALDH18A1高表达患者中C-myc的靶基因的富集情况，结果显示C-myc的靶基因在ALDH18A1高表达患者中富集。<br>　　9.根据ALDH18A1蛋白的结构特征，利用分子对接的方法从小分子化合物(>200,000种化合物)中筛选可与ALDH18A1蛋白特异性结合的小分子抑制剂YG1702。<br>　　10.用ALDH18A1的小分子抑制剂YG1702处理结直肠癌细胞系(HT29、SW620 )后，采用四唑化合物(methyl-thiazolyldiphenyl-sulfophenyl-tetrazolium bromide, MTS)比色法检测结直肠癌细胞增殖能力的变化，结果显示，YG1702抑制ALDH18A1的同时降低了结直肠癌细胞的细胞增殖能力。其中，HT29细胞系：HT29-0μg/mL组vs.HT29-5μg/mL组，P=3.8128×10-5；HT29-0μg/mL组vs.HT29-10μg/mL组，P=6.5888×10-6；HT29-0μg/mL组vs.HT29-20μg/mL组，P=6.1001×10-6；SW620细胞系：SW620-0μg/mL组vs.SW620-5μg/mL组，P=0.0027；SW620-0μg/mL组vs.SW620-10μg/mL组，P=0.0014；SW620-0μg/mL组vs.SW620-20μg/mL组，P=0.0018。<br>　　11.用ALDH18A1的小分子抑制剂YG1702处理结直肠癌细胞系后，WesternBlot、RT-qPCR实验验证抑制效率后，RT-qPCR检测自我更新基因(C-myc、CD44、CD133、ALDH1A1、Lgr5、BRCA1、FUT4、NOTCH1)的表达变化，结果显示，用不同浓度的YG1702(0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL)抑制HT29细胞中的ALDH18A1(P=0.0133、P=3.2727×10-5、P=6.5438×10-5)，HT29细胞中的自我更新基因C-myc(P=4.8057×10-6、P=3.0195×10-5、P=3.9814×10-9)、CD44(P=1.9689×10-4、P=3.7708×10-7、P=3.6459×10-7)、CD133(P=0.1595、P=9.4683×10-4、P=4.1233×10-4)、ALDH1A1(P=2.6202×10-4、P=0.0016、P=6.8989×10-4)、Lgr5(P=4.9448×10-5、P=2.7207×10-6、P=2.3775×10-6)、BRCA1(P=0.0128、P=0.0838、P=0.0046)、FUT4(P=5.8580×10-5、P=1.3043×10-6、P=3.6964×10-6)和NOTCH1(P=0.0220、P=1.8310×10-5、P=5.4100×10-5)的表达均显著降低。<br>　　12.免疫荧光实验检测小分子抑制剂YG1702处理结直肠癌细胞系后，结直肠癌细胞膜上β-Catenin的变化，结果显示，YG1702抑制ALDH18A1后，细胞膜上的β-Catenin表达量降低；WesternBlot实验检测用小分子抑制剂YG1702处理结直肠癌细胞系后，β-Catenin、E2F1蛋白表达水平的变化，结果显示，YG1702抑制ALDH18A1后，β-Catenin、E2F1蛋白表达水平也被抑制。<br>　　主要结论：<br>　　1.ALDH18A1高表达可作为结直肠癌患者的预后不良因素。<br>　　2.ALDH18A1可能通过C-myc基因调控结直肠癌细胞的增殖和自我更新。<br>　　3.ALDH18A1可能是结直肠癌患者潜在的治疗靶点，其抑制剂YG1702有望成为治疗结直肠癌的候选分子。