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摘要研究背景：<br>　　乳腺癌在全球女性肿瘤患者中，发病率及死亡率均为首位，而乳腺癌的转移和复发是导致患者死亡的主要因素。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer， TNBC)为雌激素受体(Estrogen receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone receptor， PR)、人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor，HER-2)均呈阴性的乳腺癌亚型，该亚型患者约占乳腺癌患者总体的20%-25%，临床特点是：患者年纪轻、容易发生复发和转移，预后差。因缺少有效的治疗靶点，三阴性乳腺癌的治疗至今仍是临床难题。因此，亟需探索新的靶分子及靶向药物。<br>　　现有研究显示，乙醛脱氢酶1A3(Aldehyde dehydrogenase 1A3，ALDH1A3)在TNBC患者转移灶中的表达水平明显高于原发灶；同时，ALDH1A3的表达与乳腺癌细胞系的Aldefluor活性显著正相关(R=0.91)；而与Aldefluor-/CD44-的TNBC细胞相比，接种Aldefluor+/CD44+TNBC细胞的小鼠肺转移发生率显著升高(P＜0.05)，提示ALDH1A3的表达可能与TNBC转移相关。然而，ALDH1A3表达的预后判断意义以及靶向ALDH1A3抑制TNBC转移的治疗学意义，仍有待进一步研究。因此，本研究拟使用生物信息学方法分析ALDH1A3表达与TNBC患者预后及转移相关信号通路的相关性，并进一步使用靶向ALDH1A3小分子抑制剂YD1701，探讨其对TNBC细胞迁移侵袭及自我更新能力的影响。<br>　　目的：<br>　　1.探究ALDH1A3的表达与TNBC患者临床病理参数及预后的相关性。<br>　　2.探究ALDH1A3高表达TNBC患者中转移相关生物学过程及信号通路基因的富集情况。<br>　　3.探究ALDH1A3靶向小分子抑制剂YD1701与TNBC细胞内ALDH1A3蛋白的结合及其对Aldeflour活性的抑制能力。<br>　　4.探究ALDH1A3靶向小分子抑制剂YD1701对TNBC细胞的侵袭、迁移及成球能力的影响。<br>　　方法：<br>　　1.在GEO数据库中检索包含TNBC患者生存及转移状态、总体生存期、无转移生存期等相关临床信息及患者基因表达信息的数据集(GSE10893、GSE2506 5、GSE2603)，使用Graphpad(V6.01)按生存及转移状态对患者进行分组，并绘制受试者工作特征曲线(Receiver opetaying characteristic curve，ROC)。以约登指数最高的ALDH1A3表达值为分组的Cutoff值。使用SPSS(V25.0)软件对数据集中患者的ALDH1A3表达、发病年龄及肿瘤分级等临床参数，进行列联表分析，评估ALDH1A3表达与患者的发病年龄及肿瘤分级等参数的相关性。利用Graphpad(V6.01 )软件中的柱状图(Column )分析对不同转移状态患者的ALDH1A3表达水平进行比较，并使用生存(Survive)分析功能，对两组患者的总体生存期(Overall survive，OS)及无转移生存期(Metastasis-free survive，MFS)等预后指标进行Kaplan-Meier生存分析。将患者ALDH1A3表达分组情况及临床参数导入SPSS(V25.0)软件，进行单因素和多因素COX回归生存分析，评估ALDH1A3表达与TNBC患者的OS及MFS的关系。<br>　　2.使用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis，GSEA)(V3.0)软件对GSE10893、GSE25065、GSE7390、GSE11121数据集进行GSEA分析，并使用R2基因组分析及可视化平台(hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi)和GSEA(V3.0)软件，对数据集GSE25065、GSE7390、GSE11121及包含TNBC患者基因表达信息的网络公共数据集进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集分析，以评估ALDH1A3高表达TNBC患者的肿瘤转移相关生物学过程及信号通路基因的富集情况。siRNA敲低MDA-468细胞ALDH1A3的表达，并行划痕实验评估其对迁移能力的影响。.<br>　　3.Western-blot及Aldeflour分析法，检测TNBC细胞系(HCC38、MDA-231、MDA-468)的ALDH1A3表达情况及Aldeflour活性，给予ALDH1A3特异性小分子抑制剂YD1701处理后TNBC细胞的Aldeflour活性改变。<br>　　4.细胞内热漂移实验(Cellular thermal shift assay，CETSA)检测YD1701处理对MDA-468细胞内ALDH1A3热力学稳定性的影响，绘制结合曲线，分析YD1701与TNBC细胞中ALDH1A3的结合能力。<br>　　5.划痕及Transwell侵袭实验检测YD1701处理后的TNBC细胞的迁移、侵袭能力。干细胞富集培养实验检测YD1701处理对Aldefluor+MDA-468细胞成球能力的影响。<br>　　结果：<br>　　1.GSE10893数据集列联表分析的结果显示，TNBC患者ALDH1A3表达与远处转移显著相关(P=0.005)；GSE25065、GSE2603数据集的分析结果同样显示，ALDH1A3的表达与患者远处转移显著相关(P=0.031，P=0.001)。上述三个数据集中转移与无转移患者ALDH1A3表达比较的结果表明，TNBC转移患者的ALDH1A3表达高于无转移患者(P=4.450×10-2，P=3.740×10-2，P=1.260×10-2)。Kaplan-Meier生存分析结果显示，GSE10893数据集中，高表达ALDH1A3组(n=50)患者的OS与MFS，较低表达ALDH1A3组(n=149)患者显著缩短(中位总体生存时间：715天vs915天，P=7.000×10-4；中位无转移生存时间：630天vs780天，P=1.200×10-3)；GSE25065数据集中，ALDH1A3高表达TNBC患者(n=66)的MFS较低表达患者(n=132)显著缩短(中位无转移生存时间：1131天vs1165天，P=4.220×10-2)；GSE2603数据集的分析结果也显示，ALDH1A3高表达患者的MFS显著缩短(中位无转移生存时间：1246天vs2051天，P=1.000×10-4)。进一步对上述数据集进行多因素COX回归模型分析的结果表明，在GSE10893数据集中，ALDH1A3的表达与患者的OS(P=1.000×10-3)和MFS(P=1.000×10-3)显著相关；GSE25065数据集中，TNBC患者的肿瘤分级(P=4.700×10-2)、INSS(P=7.000×10-3)分期和ALDH1A3表达(P=4.800×10-2)与MFS显著相关；GSE2603数据集中，患者的ALDH1A3表达(P=1.000×10-3)与MFS显著相关。<br>　　2.对GSE10893、GSE25065、GSE7390和GSE11121数据集的GSEA分析结果显示，ALDH1A3高表达TNBC患者的EMT途径(P=4.300×10-2，P=0.000,P=0.000,P=0.000)相关基因显著富集；对R2网站的Tumorbreast(TNBC)公共数据集和GSE25065、GSE7390、GSE11121数据集的KEGG分析结果显示，ALDH1A3高表达TNBC患者的肌动蛋白细胞骨架调节(P=2.400×10-6，P=3.992×10-3，P=0.000，P=5.474×10-3)、细胞外基质受体互作(P=5.000×10-6，P=3.651×10-2，P=0.000，P=0.000)、内皮穿越迁移(P=2.700×10-5，P=2.439×10-2，P=2.053×10-2，P=1.873×10-3)等生物学过程，及Ras(P=2.900×10-5，P=1.855×10-3，P=1.799×10-2，P=0.000)、NF-κB(P=3.200×10-4，P=8.214×10-3，P=3.357×10-2，P=3.150×10-2)等EMT相关信号通路的显著激活。<br>　　3.对不同TNBC细胞系ALDH1A3表达量检测的WB实验及Aldefluor分析实验结果表明，MDA-468细胞中ALDH1A3表达量较高，而在MDA-231及HCC38细胞中表达量较低，且MDA-468细胞的Aldefluor阳性率(44.11%)高于MDA-231(4.28%)及HCC38(1.77%)细胞的Aldefluor阳性率。在经YD1701处理后，MDA-468细胞的Aldefluor阳性率降低(27.89%vs 0.75%)。<br>　　4.CETSA结果显示，YD1701可提升MDA-468细胞内表达的ALDH1A3在高温环境下的空间结构稳定性，并可被ALDH1A3单克隆抗体特异性识别，表明YD1701可与TNBC细胞内表达的ALDH1A3结合。使用不同浓度处理MDA-468细胞并进行热漂移实验，结果显示YD1701与MDA-468细胞中ALDH1A3的半数结合浓度为10.55μg/mL。<br>　　5.划痕实验结果显示，YD1701可显著抑制TNBC细胞系的迁移能力，且具有浓度依赖性(HCC38：0vs30μg/mL，P=1.070×10-9；0vs60μg/mL，P=3.300×10-10；30μg/mLvs60μg/mL，P=1.079×10-2.MDA-231：0vs30μg/mL，P=4.280×10-2；0vs60μg/mL，P=8.000×10-4；30μg/mLvs60μg/mL，P=2.600×10-3.MDA-468：0vs30μg/mL，P=3.144×10-9；0vs60μg/mL，P=6.793×10-10；30μg/mLvs60μg/mL，P=4.390×10-2)。Transwell侵袭实验结果表明，YD1701可显著抑制TNBC细胞系的侵袭能力，并具有浓度依耐性(MDA-231：0vs30μg/mL，P=7.678×10-5；0vs60μg/mL，P=1.196×10-5；30μg/mLvs60μg/mL，P=4.452×10-2.HCC38：0vs30μg/mL，P=3.133×10-6；0vs60μg/mL，P=1.867×10-6；30μg/mLvs60μg/mL，P=1.112×10-2.)。siRNA干扰实验也显示，siRNA敲低MDA-468细胞ALDH1A3表达后，可显著抑制MDA-468细胞的迁移能力(WTvsNC，P=5.087×10-1；NCvssiRNA-1，P=2.454×10-7；NCvssiRNA-2，P=5.924×10-7；NCvssiRNA-3，P=1.139×10-6)。对经Aldefluor分选及不同浓度YD1701处理后的Aldefluor+MDA-468细胞进行干细胞富集培养实验结果显示，YD1701可抑制Aldefluor+MDA-468细胞的成球能力(0vs30μg/mL，P=9.438×10-3；0vs60μg/mL，P=3.835×10-10；30μg/mLvs60μg/mL，P=3.077×10-2)。<br>　　结论：<br>　　1.ALDH1A3高表达与TNBC患者转移密切相关，是预后不良因素之一。<br>　　2.ALDH1A3靶向小分子抑制剂YD1701可与TNBC细胞内的ALDH1A3结合，并抑制肿瘤细胞迁移、侵袭及成球能力。