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摘要目的<br>　　异烟肼(isoniazid，INH)所致肝损伤是临床常见问题，但其机制仍未完全阐释清楚。近年来在INH肝损伤研究中，发现肝脏法尼醇受体(farnesoid X receptor, FXR)的表达及活性显著降低，但肝脏FXR与INH诱导的肝损伤之间的关系未被阐明。基于此，本文拟通过体内外实验，1)明确肝脏FXR活性抑制在INH致肝损伤中的作用；2)从INH及其主要代谢物、INH与维生素B6(vitamin B6，VB6)的加合物吡哆醛异烟酰腙(pyridoxal isonicotinoyl hydrazine，PIH)及VB6中筛选潜在的FXR抑制剂；3)考察补充外源性VB6对INH肝损伤及其药动学的影响，为INH肝损伤的防治提供一定的依据。<br>　　方法<br>　　本论文涉及4部分的实验方法：<br>　　(1)肝脏核受体FXR抑制效应在异烟肼所致肝损伤中的作用研究<br>　　实验一：Wistar雄性大鼠采用INH(60、180、300及600mg/kg)或INH(300 mg/kg)加奥贝胆酸(OCA，10 mg/kg)干预1周后，收集血清、肝脏样本，测定血清生化指标并观察肝脏病理学变化；采用HPLC-MS/MS法测定血清及肝脏胆酸盐及药物浓度；采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定肝脏胆酸盐相关核受体、代谢酶及转运体的mRNA表达变化。<br>　　实验二：在含有或不含有胆酸盐的条件下，采用INH干预HepaRG细胞或FXR过表达转染的HepaRG细胞24h，评价INH对HepaRG细胞的毒性；INH干预HepaRG细胞不同时间后，采用Tunel染色法评价INH对HepaRG细胞凋亡的影响，并采用HPLC-MS/MS测定细胞内胆酸盐变化。<br>　　(2)基于INH及其主要代谢物筛选FXR潜在抑制剂<br>　　实验一：采用计算机虚拟筛选技术从INH及其主要代谢物乙酰异烟肼(ACINH)、异烟酸(INA)、乙酰肼(ACHZ)、肼(HZ)、PIH及VB6中筛选FXR受体抑制剂，并进一步采用TR-FRETFXR共激活因子检测技术进行体外活性验证；PIH干预HepaRG细胞24h后，采用RT-qPCR测定FXR及其靶基因小异源二聚体伴侣受体(SHP)及胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)的mRNA表达变化。<br>　　实验二：Wistar雄性大鼠分别采用INH(60 mg/kg)、VB6(60 mg/kg)、INH(60 mg/kg)+VB6(60 mg/kg)及PIH(5 mg/kg)干预16h后，收集血清、肝脏组织、回肠组织及回肠内容物，测定血清生化指标并采用HPLC-MS/MS法测定血清及肝脏胆酸盐和血清、肝脏组织、回肠组织及回肠内容物药物浓度；采用RT-qPCR测定肝脏Fxr受体及其靶基因Shp及Cyp7a1的mRNA表达变化。<br>　　(3)VB6在INH肝损伤中的作用研究<br>　　Wistar雄性大鼠采用INH(300 mg/kg)或INH(300 mg/kg)+VB6(90、120及150mg/kg)干预1周后，收集血清、肝脏样本，测定血清生化指标并观察肝脏病理学变化；采用HPLC-MS/MS法测定血清及肝脏胆酸盐及药物浓度；采用RT-qPCR测定肝脏胆酸盐相关核受体、代谢酶及转运体的mRNA表达变化。<br>　　(4)VB6与INH的药动学相互作用<br>　　Wistar雄性大鼠采用INH(300 mg/kg)或INH(300 mg/kg)+VB6(90、120及150mg/kg)给药后，分别于0、10、30、60、120、180、240、360、480、720、1440min心脏采血，采用HPLC-MS/MS测定血清中INH及其主要代谢物、VB6的浓度变化；此外，采用同样的给药方式干预Wistar雄性大鼠2h后，收集肝脏、肾脏及回肠组织样本，测定INH及其主要代谢物、VB6的各组织浓度。<br>　　结果<br>　　(1)肝脏核受体FXR抑制效应在异烟肼导致的肝损伤中的作用研究<br>　　肝脏病理学结果显示，INH300及600mg/kg可导致肝细胞局部坏死和脂肪变性肝损伤，且与对照组相比，INH60、180、300及600mg/kg均可使肝脏胆酸盐显著升高(p<0.05)，且INH干预后肝脏Fxr的表达和功能均降低；而INH与OCA合用后，OCA可明显缓解INH引起的肝损伤，并逆转INH所致的肝脏胆酸盐相关核受体、代谢酶及转运体的mRNA表达变化。此外，INH对HepaRG细胞具有明显的胆酸盐依赖性毒性，而在FXR过表达转染的HepaRG细胞中，INH的胆酸盐依赖性毒性消失；同时，INH引起的HepaRG细胞胆酸盐升高要早于细胞凋亡的发生。<br>　　(2)基于INH及其主要代谢物筛选FXR潜在抑制剂<br>　　计算机虚拟筛选结果显示，除ACHZ及HZ外，INH、ACINH、INA及PIH均可能为FXR抑制剂，但TR-FRETFXR共激活因子检测及细胞实验证实，只有PIH为FXR抑制剂，其IC50为52.7nM；同时，体内实验证实PIH可早期抑制肝脏Fxr功能，引起肝脏胆酸盐升高。<br>　　(3)VB6在INH肝损伤中的作用研究<br>　　INH与VB6口服合用后，与INH组相比，VB6可显著降低血清胆酸盐及肝脏总游离胆酸盐浓度(p<0.05)，并缓解肝脏病理学损伤；且VB6可上调肝脏核受体Fxr的表达，并逆转INH引起的胆酸盐相关代谢酶及转运体的mRNA表达变化；此外，VB6可呈现剂量依赖性的降低肝脏PIH的含量。<br>　　(4)VB6与INH的药动学相互作用<br>　　INH与VB6口服合用后，与INH组相比，VB6可显著减少INH、ACINH及INA的药时曲线下面积(AUC)及肝脏组织的分布(p<0.05)，增加INH、ACINH及INA的体内清除率(p<0.05)。然而，与INH组相比，VB6能显著增加PIH的AUC(p<0.05)，减少PIH的肝脏组织分布(p<0.05)。<br>　　结论<br>　　本研究通过体内外实验证实，(1)INH可降低肝脏FXR的表达及活性而引起肝脏胆酸盐蓄积，这可能是INH肝损伤的早期阶段；(2)INH与内源性VB6的形成的加合物PIH为FXR的强效抑制剂，可早期抑制肝脏FXR的活性并导致肝脏胆酸盐浓度升高，PIH为INH肝损伤中导致肝脏胆酸盐蓄积的主要物质；(3)在INH给药的同时，补充外源性的VB6后，可显著减少INH的AUC及肝脏PIH的含量，增加肝脏FXR的表达及功能，缓解INH引起的肝损伤。