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摘要第一部分：血管紧张素II受体1脑啡肽酶双重阻滞经心肌线粒体调控蛋白/IL-1β改善盐性高血压小鼠射血分数保留心力衰竭的心脏功能<br>　　背景：心力衰竭(HF)患病率逐年上升。高血压是心力衰竭中最常见的危险因素，根据左室射血分数(LVEF)将心力衰竭分为射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)、射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)以及射血分数中间值的心力衰竭(HFmrEF)。高血压是HFpEF发生的主要危险因素,尽管在过去的几十年中进行了大量的基础研究和临床试验，但针对HFpEF没有确切疗效的药物。线粒体功能的改善被认为是改善心功能的重要途径之一，因此有作为药物治疗靶标的潜力。本研究假设SAC/VAL比单独使用ARB类药物可以提供更好的心功能保护作用，其益处可能与中性内切酶的抑制有关。本研究旨在探讨SAC/VAL对醋酸去氧皮质酮(DOCA)盐性舒张性心力衰竭小鼠线粒体功能的作用，探讨SAC/VAL是否通过白细胞介素-1β(IL-1β)/心肌线粒体氧化应激改善由高血压导致的舒张性心力衰竭。因此模型小鼠具有高血压，内皮细胞功能障碍以及炎症和氧化应激增加的特点，故该研究选取DOCA盐性高血压小鼠作为HFpEF研究模型。<br>　　目的：①验证SAC/VAL对高血压导致的HFpEF小鼠心脏功能的改善作用。②探讨SAC/VAL的上述作用是否通过对心肌线粒体融合/裂变的调节。③探讨SAC/VAL对心肌IL-1β/线粒体氧化应激，线粒体膜通透性转运孔(mPTP)开放时间以及三磷酸腺苷(ATP)合成影响。<br>　　方法：30只DOCA-盐性高血压小鼠模型根据随机数字表分组，分别分为:DOCA组，DOCA+SAC/VAL组，对照组，SAC/VAL(60mg/kg.day)于晨9时对小鼠进行灌胃，每周测量一次鼠尾动脉压。每两周测定超声心动图，根据文献使用动物HF评分，并对肺脏进行重量，从中筛选出HFpEF造模成功小鼠。①超声心动图测定左室结构以及左室收缩和舒张功能(左室射血分数、左室短轴缩短率、左室质量指数、左室后壁厚度、E/E’和E’/A’)。②同时分别检测左室心肌组织和心肌细胞线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)的表达，观察心肌细胞线粒体氧化应激水平,并测定心肌细胞线粒体膜去极化所用时间。③采用WesternBlot测定线粒体促融合蛋白1(MFN1)，线粒体促融合蛋白2(MFN2)动力相关蛋白(Drp1)、线粒体裂变蛋白1(Fis1)、一型视神经萎缩蛋白(OPA1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF-1)和线粒体转录因子A(Tfam)的表达。采用SPSS22.0软件进行统计学分析。<br>　　结果：<br>　　①给予12周药物灌胃治疗后，与正常对照组比较，SAC/VAL治疗的HFpEF组，收缩压及舒张压均明显降低，但两组之间差异不具有显著性(P>0.05)。小动物超声结果显示，与对照组相比，DOCA手术小鼠左室射血分数为(DOCAvs.对照组：53.61%±2.17%vs.68.00%±6.62%,P<0.05)，E/A比降低(DOCAvs.对照组：1.803±0.16vs.2.15±0.05，P<0.05),E/E’比增加(DOCAvs.对照组：26.91±1.49vs.12.37±1.43,P<0.05),心力衰竭评分(3.1 vs. 0),肺脏重量(DOCAvs.对照组：9.97±0.34vs.9.06±0.52mg,P<0.05)，上述指标证明HFpEF模型造模成功。②SAC/VAL显著降低心肌组织和心肌细胞线粒体NOX4的表达，MitoSOXRed评估HFpEF小鼠心室肌细胞中的线粒体水平显示，线粒体活性氧簇(mitoROS)在HFpEF小鼠明显增加(P<0.05)。激光共聚焦显微镜显示SAC/VAL明显减轻心肌细胞线粒体氧化应激，延长了线粒体膜去极化时间，降低了心肌细胞mPTP开放程度，从而间接减少了线粒体ROS生成。③Westernblot结果显示：线粒体融合蛋白MFN1，MFN2以及OPA1在HFpEF小鼠表达明显减低(P均<0.05)，SAC/VAL上调了上述蛋白的表达(P<0.05)，同时，在线粒体裂变中起重要作用的Drp-1蛋白在HFpEF小鼠中上调，该现象可被SAC/VAL抑制(P<0.05)。线粒体裂变蛋白Fis1在HFpEF组中的表达明显高于对照组，但SAC/VAL虽然降低了其表达，但其差异不具有统计学意义(P>0.05)。同时，HFpEF小鼠心肌组织中PGC-1α，NRF1以及Tfam水平显著降低(P<0.05)。SAC/VAL对上述在启动线粒体生成中具有重要作用的蛋白靶点具有上调作用。<br>　　结论：<br>　　对于DOCA盐性高血压HFpEF小鼠模型，SAC/VAL对其心脏功能的改善是通过调节心肌线粒体融合/裂变以及改善心肌线粒体氧化应激，与降低心肌IL-1β有关。<br>　　第二部分：血管紧张素II受体1脑啡肽酶双重阻滞经调节IL-1β/心肌线粒体氧化应激对糖尿病射血分数保留心力衰竭小鼠心电重构的影响机制研究<br>　　背景：流行病学研究显示射血分数保留心力衰竭(HFpEF)患病率和住院率与日俱增，人口老龄化以及糖尿病，高血压的发生更加剧了这一趋势。糖尿病(DM)使得心血管疾病的临床转归趋于恶化，而对于患有HFpEF的患者，DM的存在，会使HFpEF患者的死亡率和住院率增至70-80%,并加剧了心律失常发生的风险，在此类患者中，猝死是其死亡的主要方式，占HFpEF患者总死亡率的25%。与HFpEF不同，已证实有多种药物可改善射血分数减低心力衰竭(HFrEF)患者的生存率，但迄今为止，所有经过严格测试的药物在HFpEF均没有得出明确的结论。在第一部分研究中我们发现，沙库巴曲/缬沙坦(SAC/VAL)这一药物可以通过减轻HFpEF心肌炎症状态，改善线粒体氧化应激，降低IL-1β水平。但对于DM而言，其机制尚不明确。已有研究报道，心肌巨噬细胞来源的白细胞介素-1β(IL-1β)导致QT延长并增加糖尿病HFpEF模型心律失常风险。然而，IL-1β是通过何种途径导致糖尿病HFpEF快速性心律失常尚不清楚。<br>　　目的：①本部分研究试图探讨IL-1β是通过何种途径导致糖尿病HFpEF模型的快速性心律失常。②探讨SAC/VAL是否可以预防糖尿病HFpEF模型相关的电重构及心律失常的发生。<br>　　方法：①选取C57BL/6J小鼠30只，24周龄，给予含60%kcal的高脂饮食(High-fat diet，HFD)饮食20周，诱导成为DM小鼠。对照组为低脂肪饮食饲养的24周龄小鼠。对照组小鼠和DM组小鼠随机抽取5只进行超声心动图测定。HFpEF模型造模成功标准与第一部分研究一致。给予DM小鼠SAC/VAL治疗2周，测定IL-1β水平。②将HFpEF小鼠给予白细胞介素-1β受体拮抗剂和线粒体氧化应激特异性抗体Mitotempo治疗3周，各组随机选定10只小鼠。使用LabChart多通道生理信号采集记录仪器。小鼠24周龄时，使用1.1FMillar电生理导管记录正常对照组和DM组小鼠心律失常诱导情况。通过全细胞电压钳研究离子通道，分离后的心肌细胞的电流钳测定动作电位(AP)。光学映射是一种研究心脏电生理的一种方法，可以用来评估室性心律失常。③通过LeicaSP2激光共聚焦扫描系统监测细胞内Ca2+循环进而检测Ca2+激活活性，使用共聚焦显微镜配备的60X1.4NA油浸物镜，Ca2+敏感指示剂Fluo-3AM探针进行线性扫描模式。用SPSS22.0统计软件分析数据。<br>　　结果：①与对照组小鼠相比较，HFD诱导的小鼠具有HFpEF和DM。且QT间期显著延长(DMvs.对照组:50.6±1.8msvs.41.5±0.8ms，P<0.05)，室性心律失常的诱导性显著升高(P<0.05)。②给予HFpEF小鼠SAC/VAL,明显减轻了IL-1β炎症因子水平(P<0.01)。另外，DM引起的HFpEF小鼠动作电位时程(APD)的延长(DMvs.对照组:411±15msvs.61±5ms，P<0.05)和早期去极化后(EADs)的发生率增加(P>0.05)。随着烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶氧化酶2(NOX2)和线粒体活性氧(mitoROS)的增加，心脏IL-1β升高(P<0.05)。③采用IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)以及mitoTEMPO(一种线粒体特异性抗氧化剂)治疗可以抑制IL-1β以及mitoROS。给予上述治疗后，DM引起的HFpEF小鼠，QT间期缩短，APD亦缩短，且室性心律失常诱导能力降低(P均<0.05)。此外，IL-1RA使HFpEF的mitoROS水平降低，mitoTEMPO则消除了由IL-1β介导的EAD兰尼碱受体(RyR)氧化的增强导致肌浆网(SR)自发性Ca2+释放，致使心律失常发生。IL-1RA和mitoTEMPO通过逆转RyR氧化，稳定氧化RyR，抑制Ca2+的泄露，改善QT延长以及DM引起HFpEF的心律失常诱导能力(P<0.05)。<br>　　结论：DM引起HFpEF相关的心肌电生理变化是由IL-1β和mitoROS介导的。SAC/VAL通过抑制IL-1β及其导致的线粒体ROS的调节，介导DM引起的HFpEF相关的心律失常。其涉及的机制为IL-1β可以导致线粒体氧化应激增加，RyR氧化，Ca2+释放增加。以上可能是DM引起的HFpEF相关的心律失常潜在机制，因此针对上述环节的改善可以为DM引起的HFpEF患者治疗提供潜在的新的治疗靶标。