检索历史 清除

摘要研究背景：桥粒芯糖蛋白-2(desmoglein2,DSG2)，是桥粒芯糖蛋白家族成员。DSG广泛存在于上皮，心肌等组织中，介导细胞与细胞间的连接，在肿瘤的发生发展中起到十分重要的作用。我们的前期工作已证实，在食管鳞癌组织中，与该家族其他成员不同，DSG2呈显著上调表达，且其过表达能够促进食管鳞癌细胞的移动。研究表明，在多种恶性肿瘤中，DSG2的蛋白水解片段可以影响细胞内的相关信号从而控制细胞的迁移和凋亡等。然而更多深层次的问题尚不清楚，比如：1)DSG2在食管鳞癌中是否存在蛋白水解片段及其对食管鳞癌细胞功能有何影响？2)在食管鳞癌中，DSG2蛋白与哪些功能蛋白相互作用，形成蛋白复合物，参与食管鳞癌的恶性进展？3)在食管鳞癌中，DSG2是否存在翻译后修饰以及该修饰是如何调控的？4)DSG2在食管鳞癌中的临床意义是什么？基于此，本文旨在对上述科学问题开展深入的研究，为深刻认识食管鳞癌中DSG2蛋白功能作用的本质提供丰富的实验数据资料。<br>　　实验方法：运用免疫共沉淀、免疫荧光和Westernblotting等实验方法，鉴定DSG2相互作用蛋白。通过细胞划痕实验和Transwell实验，确定DSG2胞内段及其互作蛋白在食管鳞癌细胞中的功能。通过ELISA实验验证DSG2在食管鳞癌患者血清中的表达水平及诊断效能。<br>　　实验结果：1)食管鳞癌细胞中存在DSG2胞内水解片段，片段大小约为55-65kDa；且胞内段过表达细胞组移动能力显著增强；2)食管鳞癌细胞系蛋白质谱分析发现DSG2蛋白胞内段存在多个磷酸化修饰位点；3)食管鳞癌细胞系中免疫共沉淀DSG2蛋白，筛选出两种激酶蛋白：蛋白激酶D-2(PRKD2)和蛋白激酶C(PRKCI)，免疫共沉淀实验显示，DSG2与PRKD2相互作用。免疫荧光证实两者共定位于细胞膜；4)免疫共沉淀实验证实PRKD2能够增强DSG2丝氨酸磷酸化修饰；且能够改变DSG2在细胞膜的定位；5)通过PRKD2高表达实验和siRNA干扰实验，证实PRKD2能促进食管鳞癌细胞的迁移；6)食管鳞癌细胞中，证实CAV1与DSG2存在相互作用，且高表达能够促进食管鳞癌细胞的移动；7)DSG2和PRKD2同时高表达的食管鳞癌患者，具有较差的预后；且可作为食管鳞癌患者独立的预后因子；8)ELISA法检测结果显示，食管鳞癌患者血清中DSG2高表达，且具有一定的诊断效能，暗示DSG2可作为潜在的食管鳞癌诊断血清分子标志物。<br>　　结论：本文首次证实了在食管鳞癌细胞中DSG2存在胞内水解片段，且其胞内段可增强食管鳞癌细胞的迁移。免疫共沉淀DSG2蛋白，筛选出互作蛋白PRKD2、CAV1，并对其功能进行初步研究。其中PRKD2能够使DSG2磷酸化，改变其细胞膜的定位。此外，PRKD2和DSG2协同可影响食管鳞癌患者的生存时间。