检索历史 清除

摘要作为机体抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线，天然免疫在保护机体健康方面发挥了重要作用。其主要通过模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)对病原微生物高度保守的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPS)进行识别，诱导干扰素产生，发挥抗病毒效应进而保护机体健康。RIG-I样受体(RIG-I-like receptor, RLR)家族是一类重要的胞质PPRs，该家族由维甲酸(视黄酸)诱导基因I(Retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)和遗传学与生理学实验室蛋白2(Laboratory of genetics and physiology 2, LGP2)三个成员组成。MDA5和RIG-I能够识别不同类型的病毒RNA，产生抗病毒作用。LGP2由于缺少CARD区，起着调控RIG-I和MDA5的活性的作用。<br>　　与哺乳动物不同，鸡天然缺失RIG-I。对鸡而言MDA5在抗病毒天然免疫过程中的作用极为重要。目前对于哺乳动物MDA5的研究有很多，但是关于鸡MDA5介导的信号传导途径及其调控机制的研究仍有很大空缺。本研究通过质谱鉴定和二代测序两种技术方法，从蛋白质和mRNA水平，对鸡MDA5介导的信号传导途径及其调控机制进行了研究。研究结果如下：<br>　　1.鸡MDA5互作蛋白的鉴定及其调控鸡IFN-β产生的机制研究<br>　　通过GST-pulldown结合质谱分析的方法，鉴定到336个可能与鸡MDA5互作的蛋白。GO和KEGG分析后发现，这些互作蛋白在分子生物功能上主要与杂环化合物结合、蛋白质结合、离子结合等有关。互作网络分析发现这些互作蛋白主要涉及到溶酶体、剪接酶体、RNA转运、蛋白质加工等途径。我们从鉴定到的互作蛋白中克隆到60个基因，研究了这60个基因对鸡IFN-β启动子活性的影响。接着选取了在鸡MDA5-N和鸡MDA5两种刺激下都能影响鸡IFN-β的启动子活性的10个基因(鸡DDX5、EEF1A1、RBM39、PABPC1、HSPA5、HSPA8、HSP70、hnRNPH2、IFIT5、PRDX1)，探究这些基因对鸡IFN-β产生的影响。CO-IP和IFA实验结果表明鸡DDX5、HSPA8、HSP70、hnRNPH2、IFIT5、PRDX1这6个蛋白与鸡MDA5-N互作。通过进一步对鸡hnRNPH2蛋白研究发现，鸡hnRNPH2减弱鸡MDA5与鸡MAVS的互作，抑制鸡IFN-β产生。<br>　　2.过表达鸡MDA5和双链RNA模拟物poly(I:C)刺激的DF1细胞转录组测序分析<br>　　对测序数据进行生物信息学分析，筛选差异表达基因，发现过表达鸡MDA5后的DF1细胞中差异表达基因有1007个，其中737个上调基因，270个下调基因；poly(I:C)刺激后的DF1细胞中差异表达基因745个，其中405个上调基因，340个下调基因。两种不同情况下都差异表达的基因有85个，其中62个上调基因，23个下调基因。对差异表达基因进行通路富集分析发现，过表达鸡MDA5组中差异表达基因富集分析排名前20个通路中多数与免疫相关，poly(I:C)刺激组中差异表达基因富集分析排名前20个通路与生物合成和代谢以及流感病毒感染等有关。接着我们选取了在两种不同情况下都上调表达的9个基因(鸡MX1、IFI6、IFIT5、RSAD2、OASL、CMPK2、HELZ2、EPSTI1和OLFML1)，通过Real-timePCR验证了转录组数据的可靠性。进一步研究发现鸡MX1、IFI6、IFIT5、RSAD2和OASL抑制流感病毒H5N6感染DF1细胞。<br>　　本研究不仅加深了对鸡MDA5信号传导调控机制的理解，也为鸡的抗病毒研究奠定理论基础。