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2型糖尿病环境中BMAL1调控p53在BMSCs成骨分化的机制

摘要目的:<br>  本研究拟通过对2型糖尿病骨髓间充质干细胞(BMSCs)中BMAL1与p53的表达情况进行检测,探究在2型糖尿病的环境中,BMAL1通过p53调控BMSCs成骨分化的具体机制,为防治2型糖尿病骨缺损和BMSCs在临床中的应用提供实验基础和理论依据。<br>  方法:<br>  (1)应用GK大鼠来建立2型糖尿病的大鼠模型,并进行筛选,Wistar大鼠设置为对照组。分离并体外培养GK大鼠BMSCs和Wistar大鼠BMSCs。通过流式细胞仪检测及茜素红和油红O染色对两组BMSCs细胞表面标志物和多向分化能力进行检测,继而对两组细胞进行鉴定并观察两组间差异。(2)应用慢病毒感染技术在GKBMSCs中过表达BMAL1,分别对Wistar BMSCs、GK BMSCs和GK-BMAL1BMSCs进行成骨诱导7天,通过Western Blot、qRT-PCR和碱性磷酸酶染色对各组细胞的成骨分化情况进行检测。同时,检测各组BMSCs的增殖和凋亡情况,以期明确BMSCs的增殖与其成骨分化之间的关系。(3)通过qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光检测3组BMSCs中p53和p21的表达水平,探究2型糖尿病中BMAL1与p53的相互关系。使用p53抑制剂pifithrin-α(PFT-α)降低GK BMSCs和过表达BMAL1的GK BMSCs中的p53表达,针对各组BMSCs中成骨标志物的表达及Alp活性进行检测和分析。为排除PFT-α的潜在非特异性效应,本课题应用基因沉默技术(p53shRNA)下调GK BMSCs和过表达BMAL1的GK BMSCs中p53的水平,重复上述实验内容。<br>  结果:<br>  1.在本研究中,2型糖尿病GK大鼠模型的构建成功率是80%。<br>  2.Wistar BMSCs和GK BMSCs的细胞表面标志物表达无显著差异,并且二者均具有多向分化能力,但GK BMSCs的成骨分化能力较Wistar BMSCs低。<br>  3.成骨诱导7天后,GK BMSCs中Runx2、Alp、Ocn和Osx的水平和Alp活性显著低于Wistar组。而过表达BMAL1后GK BMSCs中成骨标志物表达水平及Alp活性明显升高,甚至高于Wistar组。Ocn的表达在过表达BMAL1的GK BMSCs和GK BMSCs间无显著性差异。<br>  4.GK BMSCs的增殖能力较Wistar BMSCs明显降低,且更容易被诱导凋亡。GK BMSCs的成骨分化能力随着其增殖代数的增加而呈现出下降趋势,第6代BMSCs的Alp活性较同组第4代细胞明显降低。过表达BMAL1可明显改善上述情况。<br>  5.相对于Wistar组,BMAL1在GK BMSCs中的表达水平明显降低,而p53和p21的水平则表现为显著升高。过表达BMAL1可使GK BMSCs中p53和p21的表达水平降低,甚至低于Wistar BMSCs。<br>  6.应用PFT-α或p53shRNA后,GK BMSCs和过表达BMAL1的GKBMSCs中p53表达被显著抑制。经PFT-α或p53shRNA处理的GK BMSCs和过表达BMAL1的GK BMSCs在成骨诱导7天后,Runx2、Osx和Alp水平和Alp活性均比各组未经PFT-α或shRNA处理的BMSCs显著升高,经PFT-α或p53shRNA处理的过表达BMAL1的GK BMSCs的成骨分化能力在各组中最高,甚至高于Wistar BMSCs。但BMAL1的表达水平在PFT-α或p53shRNA处理前后无显著变化。<br>  结论:<br>  1.BMSCs的增殖和成骨分化能力在2型糖尿病中显著下降。<br>  2.在2型糖尿病环境中,BMAL1参与了对p53信号通路的调控。<br>  3.在2型糖尿病的BMSCs中,BMAL1下调激活p53,使其表达增高,进而对BMSCs的成骨分化产生抑制作用。<br>  4.在2型糖尿病中,过表达BMSCs中的BMAL1能够下调p53,这有助于恢复BMSCs受损的增殖和成骨分化潜能。<br>  5.BMAL1可能成为骨组织工程中2型糖尿病骨缺损修复治疗的新靶点。

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导师 郭斌
学位信息:
中国人民解放军医学院解放军医学院;解放军总医院;军医进修学院 口腔医学 口腔临床医学(博士) 2020年
分类号 R687.34
发布时间 2020-12-31
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