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摘要背景与目的：<br>　　口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)在全世界的发病率位列恶性肿瘤的第六位。OSCC具有侵袭性强、易发生区域性淋巴结转移、易复发、耐受放疗等特点，因此，尽管外科学和各类辅助治疗手段不断进步，但OSCC的五年生存率仍不足50%。<br>　　随着医学的进步，microRNA(miRNA)作为一种全新的肿瘤治疗的潜在靶点和肿瘤诊断的新型标志物而受到广泛关注，miRNA通过对肿瘤主要相关信号通路的调控影响肿瘤的表型，如miR-99a在肝癌、肺癌、前列腺癌中对Notch信号通路进行调控，起到抑癌或促癌的作用。Notch通路高度保守，已被证明可以调控肿瘤的增殖、凋亡以及分化，其主要基因Notch1的突变与OSCC患者的预后紧密相关。然而，对于miR-99a与Notch信号通路在调控OSCC发生发展中的机制研究未见报道。<br>　　本研究通过对OSCC中miR-99a调控mTOR/Notch信号通路的机制进行分析，探讨该机制对OSCC增殖、凋亡等功能的影响及潜在应用价值。<br>　　方法：<br>　　1.分析LinkedOmics数据库中11158名患者的多组学信息数据，筛选得出HNSCC中与Notch1表达相关的miRNA，通过microRNA微阵列芯片表达分析，筛选出在OSCC癌及正常口腔黏膜组织中差异表达的miRNA。<br>　　2.收集10例确诊的OSCC癌组织及正常口腔黏膜组织，q-PCR检测其中miR-99a的表达差异。<br>　　3.以人舌鳞癌Tca-8113细胞系为研究对象，分别转染miR-99a mimics及其对照组miR-99a mimics NC，q-PCR、Western blot检测Notch1及凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3的mRNA及蛋白表达；CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，评估miR-99a对Tca-8113细胞增殖、凋亡和周期的影响。<br>　　4.靶基因预测软件DIANA-TarBase、miRTarBase、miRDB、ENCORI、TargetScan分别预测miR-99a的靶基因，其结果取交集绘制维恩图，利用TargetScan Human预测miR-99a与靶基因的结合位点，通过q-PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因实验对预测靶基因进行验证。<br>　　5.以Tca-8113细胞为研究对象，将mTOR-vector单独或联合miR-99a mimics转染Tca-8113细胞，通过q-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3以及Notch1的mRNA和蛋白表达水平；通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期，CCK-8实验检测细胞增殖。<br>　　6.以Tca-8113细胞为研究对象，将si-mTOR单独或联合miR-99a inhibitor转染Tca-8113细胞，通过q-PCR和Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3以及Notch1的mRNA和蛋白表达水平；通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期，CCK-8实验检测细胞增殖。<br>　　结果：<br>　　1.利用LinkedOmics数据库筛选出HNSCC中与Notch1表达相关的633个miRNA，Spearman相关性分析得知，与Notch1表达最正相关的miRNA为miR-99a（p＜0.05）；通过microRNA微阵列芯片表达分析可知，与正常口腔黏膜组织相比，OSCC癌组织中差异表达的miRNA共73个，其中包括34个miRNA表达上调，39个miRNA表达下调，下调表达的miRNA中包括miR-99a（Fold-change≥2且P＜0.05）。<br>　　2.q-PCR结果显示，与正常口腔黏膜组织相比，miR-99a在OSCC癌组织中的表达量下调（p＜0.05）。<br>　　3.Tca-8113细胞中，过表达miR-99a后，q-PCR、Western blot结果显示，Bcl-2的mRNA和蛋白表达均降低（p＜0.05），Caspase-3和Notch1的mRNA和蛋白表达均升高（p＜0.05）；CCK-8细胞增殖实验结果显示，细胞增殖能力减弱（p＜0.05）；流式细胞术检测细胞周期实验结果显示，G1期细胞比例增加（p＜0.05），S期细胞比例减少（p＜0.05），抑制细胞G1/S期转换；流式细胞术检测细胞凋亡实验结果显示，早期和晚期凋亡率均增加（p＜0.05）。<br>　　4.依据5个数据库的预测结果取交集，绘制维恩图，得出9个相对可靠的靶基因：KBTBD8、HOXA1、FGFR3、mTOR、RAVER2、SMARCA5、AGO2、MTMR3、TRIB2；利用targetScanHuman预测miR-99a可能靶向mTOR mRNA3’-UTR的一个保守位点；q-PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-99a对mTOR的mRNA及蛋白表达起负调控作用（p＜0.05），mTOR是miR-99a直接的下游靶基因，miR-99a与mTOR mRNA的3’-UTR区进行碱基互补结合。<br>　　5.NC-vector和mTOR-vector分别转染Tca8113细胞后，mTOR-vector组G1期细胞比例减少（p＜0.05），S期细胞比例增加（p＜0.05），细胞增殖能力增强（p＜0.05），细胞凋亡能力减弱（p＜0.05），Bcl-2的mRNA和蛋白表达均升高（p＜0.05），Caspase-3、Notch1的mRNA和蛋白表达均降低（P＜0.05）；与miR-99a mimics NC＋mTOR-vector转染组相比，miR-99a mimics＋mTOR-vector转染组G1期细胞比例增加、S期细胞比例减少（p＜0.05），细胞增殖能力减弱（p＜0.05），细胞凋亡能力增强（p＜0.05），Bcl-2的mRNA和蛋白表达降低（p＜0.05），Caspase-3、Notch1的mRNA和蛋白表达均升高（P＜0.05）。<br>　　6.si-NC和si-mTOR分别转染Tca8113后，si-mTOR组G1期细胞比例增加（p＜0.05），S期细胞比例减少（p＜0.05），细胞增殖能力减弱（p＜0.05），细胞凋亡能力增强（p＜0.05），Bcl-2的mRNA和蛋白表达均降低（p＜0.05），Caspase-3、Notch1的mRNA和蛋白表达均升高（P＜0.05）；与miR-99a inhibitor NC＋si-mTOR转染组相比，miR-99a inhibitor＋si-mTOR转染组G1期细胞比例减少、S期细胞比例增加（p＜0.05），细胞增殖能力增强（p＜0.05），细胞凋亡能力减弱（p＜0.05），Bcl-2的mRNA和蛋白表达均升高（p＜0.05），Caspase-3、Notch1的mRNA和蛋白表达均降低（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.miR-99a在OSCC癌组织中低表达。<br>　　2.miR-99a过表达可抑制Tca-8113细胞增殖，促进Tca-8113细胞凋亡，抑制细胞G1/S期转换。<br>　　3.mTOR为miR-99a的直接靶基因，miR-99a与mTOR mRNA通过3’-UTR区碱基互补结合。<br>　　4.miR-99a通过调控mTOR/Notch信号通路影响OSCC的增殖和凋亡。