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摘要MicroRNA作为一种单链的非编码RNA，广泛的参与了许多疾病的病理生理进程。因此，在HIV促进HCV的相关肝病中，MicroRNA估计也起到了一定的作用。MicroRNA大小大约为22个核苷酸，广泛存在于大量真核细胞内。它主要通过mRNA3'非编码区形成完全或局部的互补，来达到抑制编码区的降解，并在转录水平上具有逆向表达调控目的基因的作用。文献报道DEAD-box RNA解旋酶家族的RNA结合蛋白DDX1能促进原代microRNA的成熟并以此抑制卵巢肿瘤的进展。而近期有研究发现，血浆miR-21的特异性表达可能反映了慢性HIV/HCV联合感染的复杂致病机制，提示miR-21可能有作为反映慢性HIV/ HCV共感染期间疾病进展的生物标志物，它在HCV感染和肝纤维化的进程中都发挥了一定的作用。当然疾病的进程不可能是由一种因素所决定的，血浆中的其它microRNA也可能参与了这一复杂的进程。其中microRNA-542-3p可以通过靶向多种类型人类癌症的各种致癌基因而发挥肿瘤抑制作用，揭示了microRNA-542-3p具有一定的抑制肿瘤的功效。近年来的研究发现microRNA在肝脏纤维化的进展中发挥着重要的作用。但是对于其在肝纤维化进程中的具体作用还未有深入的探讨。存活蛋白基因是BIRC5基因的蛋白质产物，位于染色体17q25的端粒位点。它既可以抑制细胞凋亡也能够促进细胞增殖。存活蛋白基因的表达具有高度特异性，可在大多数肿瘤组织中过量表达，但它不能在大多数正常组织中表达。这种特性使它成为了一个理想的肿瘤基因治疗的靶点。有趣的是，根据生物信息学的分析，存活蛋白基因也可能是microRNA-542-3p的潜在作用位点。<br>　　在本研究中，我们首先运用慢病毒介导的过表达载体，它能够充分的增加DDX3在肝癌细胞株Huh7细胞中的表达量，DDX3的过表达显著的抑制了Huh-7细胞的活力和迁徙能力。我们的目的是在于探讨DDX3在肝癌细胞系中的作用，并进一步研究DDX3在HIV和HCV中的表达效果。因此，我们首先探索DDX3与人类肝癌细胞之间的联系，再进一步评估HCV、HIV和DDX3之间的关系，我们发现HIV的Tat蛋白或者Rev蛋白的转染能够引发DDX3的表达，而且当它们共转染时能够显著的增加DDX3的表达水平。当Tat蛋白或者Rev蛋白过表达后，将抑制HCV中mRNA的水平，而当它们共转染时，却能够显著的增加HCV中的mRNA水平。我们认为造成这种情况的原因是HIV的Tat和Rev蛋白与DDX3形成了复合体，降低了细胞中DDX3的水平，因此抑制了HCV RNA的复制。而当HIV-Tat与HIV-Rev共感染时，大量的DDX3被诱导出来加速了Huh7细胞中HCV的复制。<br>　　接着我们研究了 microRNA-542-3p在肝纤维化组织中的表达谱并验证了microRNA-542-3p的过表达对肝纤维化细胞生长的影响。而且对microRNA-542-3p和存活蛋白基因3'-UTR的相互关系也得到了明确。最后我们进一步的摸清了 microRNA-542-3p与存活蛋白基因在肝脏纤维化之间的关系。我们的研究最初着眼于microRNA-542-3p靶向存活蛋白基因的3'-UTR来抑制肝纤维化细胞的增殖并促进其凋亡。通过实验，我们验证了microRNA-542-3p能够有效的下调肝纤维化组织。为了进一步了解microRNA-542-3p的功能，我们通过在体内外过表达 microRNA-542-3p，并观察它在肝纤维化细胞中的作用，结果显示过表达的microRNA-542-3p能够显著增加肝纤维化细胞的凋亡水平，有效的阻止细胞周期循环，并在体内引起了肝细胞体积和质量的流失。为阐明microRNA-542-3p在肝纤维化进展中所起作用的分子机制，我们运用了多种生物信息学的方法来预测microRNA-542-3p的靶位基因。我们利用网站上的相关软件进行分析，通过生物信息学的分析所反馈回来的结果来看，证实了存活蛋白基因3'-UTR端具有microRNA-542-3p的潜在结合位点。为验证microRNA-542-3p是否直接通过与存活蛋白基因的相互作用来抑制肿瘤的生成，我们通过双荧光素酶报告分析和蛋白免疫印迹实验来加以证实。试验中， microRNA-542-3p荧光素酶活性模拟组显著的降低而 microRNA-542-3p抑制组明显的增高。但当我们将microRNA-542-3p的结合位点绑定到存活蛋白基因3'-UTR上时，荧光素酶的活性没有发生任何的改变。我们通过在肝纤维化细胞中过表达microRNA-542-3p后，发现细胞内存活蛋白基因的表达受到了抑制。而当我们抑制microRNA-542-3p的表达时，存活蛋白基因的表达得到了强化。为进一步核实microRNA-542-3p与存活蛋白基因在肝纤维化细胞中的相互作用，我们在体内和体外过表达存活蛋白基因，并观察其对microRNA-542-3p的影响。过表达的存活蛋白基因代偿了microRNA-542-3p的作用并抑制了细胞的增殖。通过RT-PCR和WB分别检测microRNA-542-3p和存活蛋白基因的表达效率，我们发现下调microRNA-542-3p在肝纤维化组织中的表达与上调存活蛋白基因的表达互相关。<br>　　主要研究成果<br>　　1.成功实现DDX3在各种肝癌细胞系中的基因表达，提示DDX3参与了肝癌的发生和发展过程，并具有潜在的调控肿瘤生长、侵袭的能力。通过观察DDX3在人肝癌细胞系Huh-7、HepG2、HepG2.2-15、Bel7402、SMMC7721和正常肝细胞系LO2的表达，结果显示DDX3在肝癌细胞系中的表达显著下降，提示DDX3与肝癌的发生发展相关，具有调控肿瘤生长、侵袭的能力。<br>　　2.构建Tat、Rev及DDX3过表达载体，并在肝癌细胞Huh7中表达。DDX3过表达质粒转染Huh-7细胞，MMT法检测细胞的增殖能力结果显示：转染DDX3过表达质粒后， Huh-7细胞增殖能力显著降低表明：DDX3具有抑制肝癌细胞增殖的能力。DDX3过表达质粒转染Huh-7细胞，细胞迁移实验检测细胞的迁移能力，结果显示：Huh7细胞迁移能力显著较低，表明了DDX3具有抑制肝癌细胞侵袭迁移的能力。<br>　　3.通过qPCR以及Western Blot证实了Tat、Rev过表达后，DDX3的表达也显著增加，对应的HCV的复制水平也显著加强。Huh-7细胞转染pCDNA3.1-JFH1、pCDNA3.1-JFH1-Tat和pCDNA3.1-JFH1-Rev质粒。转染后WB检测细胞中DDX3的蛋白表达。显示pCDNA3.1-JFH1转然后不会引起 DDX3的表达，而 pCDNA3.1-JFH1-Tat和 pCDNA3.1-JFH1-Rev转染后会诱导 DDX3的表达，同时转染 pCDNA3.1-JFH1-Tat和 pCDNA3.1-JFH1-Rev效果更显著。同时， qRT-PCR结果显示，单独转染 pCDNA3.1-JFH1-Tat和pCDNA3.1-JFH1-Rev质粒，会下调细胞中HCV mRNA的表达；而同时转染pCDNA3.1-JFH1-Tat和pCDNA3.1-JFH1-Rev会显著上调HCV mRNA的表达。<br>　　4. MicroRNA-542-3p在肝纤维化组织中低表达，过表达的microRNA-542-3p抑制细胞增殖、促进凋亡。检测miRNA-542-3p在正常干细胞LO2,肝癌细胞株Huh7，肝纤维细胞HF，以及Hep3B和MHCC-LM9细胞。发现，相对于正常的肝细胞株，microRNA-542-3p在肝纤维化细胞系中的表达量是下调的。过表达microRNA-542-3p慢病毒感染3T3细胞， CCK-8检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。发现过表达microRNA-542-3p能够通过降低细胞活性来抑制肝纤维化细胞的增殖。运用流式细胞仪测试细胞的凋亡水平，发现microRNA-542-3p过表达组能显著的促进细胞凋亡。此外，通过流式细胞仪观察转染microRNA-542-3p mimic后细胞周期的分布情况发现，microRNA-542-3p过表达组能使细胞周期在G0/G1期阻滞。<br>　　5.证实 survivin是 microRNA-542-3p的靶基因， qPCR、WB检测细胞过表达microRNA-542-3p后α-SMA的表达明显增加。显示在microRNA-542-3p过表达后，α-SMA的mRNA和蛋白水平均显著降低。以CCl4诱导的肝纤维化模型为研究对象，并在诱导成功后再肝脏组织中注射 microRNA-542-3p过表达慢病毒，发现肝纤维化模型肝脏中Collagen1、TGF-beta1和a-SMA表达量均显著提高；表明microRNA-542-3p过表达能改善肝纤维化进程。<br>　　主要结论<br>　　1. DDX3过表达载体能够抑制肝癌细胞的活性和迁徙能力；Tat和Rev质粒转染后会诱导DDX3的表达，同时转染效果更显著。<br>　　2.单独转染Tat和Rev质粒，会下调细胞中HCV mRNA的表达；而同时转染Tat和Rev会显著上调HCV mRNA的表达。<br>　　3. MicroRNA-542-3p在肝纤维化组织中低表达，过表达的microRNA-542-3p抑制细胞增殖、促进凋亡；microRNA-542-3p过表达能改善肝纤维化进程。