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摘要目的:1.通过临床病例分析，检测HCC组织样本中HIF-1α、PIP2和CAPZA1的表达，探讨三者之间表达的相关性，明确其表达改变对HCC患者临床病理因素及预后的影响，为后续的机制研究提供依据。<br>　　2.建立体外缺氧培养模型，在肝癌细胞水平上研究缺氧对PIP2水平的影响，并验证缺氧是否通过激活HIF-1α/RhoA/ROCK信号通路促进PIP2的合成。<br>　　3.阐明CAPZA1通过影响细胞骨架重塑对肝癌细胞侵袭转移发挥关键负向调控作用的内在机制；研究PIP2与CAPZA1的相互作用以及PIP2对CAPZA1的调控机制。<br>　　4.构建裸鼠肝脏原位移植癌模型，在动物水平上探讨阻断HIF-1α/PIP2/CAPZA1信号通路对HCC侵袭转移的影响，探讨以肌动蛋白丝细胞骨架重塑为靶点的HCC侵袭转移防治策略的可行性。<br>　　方法：1.采用免疫组化检测HCC组织中HIF-1α、PIP2和CAPZA1的水平，并用Image J软件分别评估三者的阳性率（包括肝癌细胞阳性率和染色深浅）。根据它们的阳性率分别将HCC病例分为HIF-1α高表达组（HIF-1α-OE）和HIF-1α低表达组（HIF-1α-UE）、PIP2低水平组（PIP2-Low）和PIP2高水平组（PIP2-High）以及CAPZA1高表达组（CAPZA1-OE）和CAPZA1低表达组（CAPZA1-UE），分别统计上述分组病例间HCC的肿瘤大小、TNM分期、病理分化、血管侵犯以及患者预后等的差异。<br>　　2.在体外用400μM二氯化钴（CoCl2）模拟缺氧环境培养肝癌细胞，采用Dot blot、PIP2ELISA和免疫荧光等实验检测PIP2在肝癌细胞内的水平，RhoA-GTP pull down实验检测活化态RhoA的水平，western blot检测HIF-1α、RhoA、ROCK1和CAPZA1的表达及免疫荧光观察肝癌细胞内肌动蛋白丝细胞骨架的状态和分布。通过加入化学抑制剂YC-1抑制HIF-1α、C3转移酶蛋白抑制RhoA和Y-27632抑制ROCK等方法验证HIF-1α/RhoA/ROCK1信号通路的存在及其活化对肝癌细胞膜上PIP2的合成和肌动蛋白丝细胞骨架重塑的调控作用。<br>　　3.通过感染CAPZA1干扰慢病毒LV10-CAPZA1和CAPZA1过表达慢病毒LV8-CAPZA1以操控肝癌细胞内CAPZA1的表达，并采用Transwell、划痕实验、Western blot、qPCR、免疫共沉淀和免疫荧光等技术观察CAPZA1对肝癌细胞的侵袭、迁移、EMT和F-actin水平的影响；利用PIP2包被的酰胺珠进行亲和沉淀实验验证PIP2与CAPZA1相互作用；采用直接添加Neomycin封闭PIP2以阻断PIP2与CAPZA1的结合和直接加入PIP2以增强PIP2与CAPZA1的结合，并利用免疫共沉淀、细胞亚结构定位和免疫荧光等技术证明PIP2与CAPZA1的相结合可改变CAPZA1在细胞骨架和胞浆中的分布及其对肌动蛋白丝细胞骨架重塑的影响。<br>　　4.通过接种CAPZA1稳定低表达的SMMC-7721细胞和CAPZA1稳定高表达的MHCCLM3细胞构建裸鼠肝脏原位移植癌模型，6周后利用小动物磁共振和摘取裸鼠肝脏观察裸鼠体内HCC的病灶数目；通过接种MHCCLM3细胞构建裸鼠肝脏原位移植癌模型，予Neomycin腹腔注射治疗裸鼠1月，并通过分析肝脏表面HCC病灶数目判断Neomycin抑制HCC侵袭转移的效果。<br>　　结果：1.与HIF-1α-UE组相比，HIF-1α-OE组的肿瘤直径显著较大（7.96±3.56cm VS.6.67±3.57cm，P=0.046），且处于于TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的病例数（75.0%VS.50.0%,P=0.036）和处于病理分化中低分化的患者数量（23.6%VS.5.6%,P=0.016）均显著较多；HIF-1α-OE组患者的术后5年无瘤生存率和术后5年生存率均低于HIF-1α-UE组。与PIP2-Low组相比，PIP2-High组的HCC的肿瘤直径更大（8.52±4.00cm VS.6.66±3.59cm，P=0.018），血管侵犯率更高（44%VS.23.9%,P=0.038），且其处于TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的病例数也显著较多（82%VS.52.1%，P=0.010）；比较两组患者的预后发现，PIP2-High组患者的术后5年生存率显著低于PIP2-Low组。在60例HCC癌和癌旁相配对的组织中，CAPZA1在癌旁中的表达高于其在癌组织中表达的有44例（P=0.001）。与CAPZA1-OE组相比，CAPZA1-UE组HCC的血管侵犯率显著较高（45.1%VS28.9%,P=0.038），且其处于TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的患者数量（77.5%VS57.8%,P=0.002）和处于HCC病理分化中低分化的患者数量（29.6%VS7.2%,P=0.001）也明显较多；比较两组患者的预后发现，CAPZA1-UE组患者术后5年无瘤生存率和术后5年生存率均低于CAPZA1-OE组。<br>　　2.与20%O2培养组相比，1%O2培养组和CoCl2处理组中肝癌细胞内HIF-1α、RhoA和ROCK1的表达水平均升高，但三组中CAPZA1的表达均未发生变化。随CoCl2处理时间的延长，肝癌细胞内HIF-1α、RhoA、ROCK1的表达和PIP2的水平均呈梯度升高。YC-1可抑制缺氧导致的HIF-1α蓄积，同时也抑制了肝癌细胞内RhoA和ROCK1的表达。在缺氧条件下，加入C3转移酶蛋白可抑制肝癌细胞内RhoA的活化和ROCK1的表达。在缺氧条件下，肝癌细胞内PIP2和F-actin的水平增加，且F-actin呈细长丝状；而加入Y-27632可抑制肝癌细胞内PIP2的合成和F-actin的装配。<br>　　3.CAPZA1在HCCLM3细胞中的表达最高，在SMMC-7721细胞内的表达最低。干扰CAPZA1的表达可促进肝癌细胞SMMC-7721的侵袭和迁移，上调CAPZA1的表达可抑制肝癌细胞SMMC-7721和MHCCLM3的侵袭和迁移。干扰CAPZA1在肝癌细胞内的表达，可下调E-cadherin的表达，而上调Vimentin的表达；上调CAPZA1在肝癌细胞内的表达，可上调E-cadherin的表达，而下调Vimentin的表达。CAPZA1可与F-actin相互作用，并且干扰CAPZA1的表达可升高肝癌细胞内F-actin的水平。包被PIP2的酰胺珠可将CAPZA1从细胞裂解液中拉出来。细胞亚结构定位、Transwell和划痕实验显示，加入Neomycin阻断PIP2与CAPZA1的结合后，CAPZA1更多地结合在细胞骨架上，而在胞浆中的分布减少，并可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移；加入人工合成的PIP2增强PIP2与CAPZA1的结合后，CAPZA1结合在细胞骨架上的数量减少，而在胞浆中的分布增多，并可增强肝癌细胞的侵袭和迁移。<br>　　4.接受Neomycin治疗的裸鼠肝脏表面肿瘤病灶较少，且主要局限于原发部位；而接受无菌水治疗的裸鼠肝脏表面均匀布满肿瘤病灶（P=0.0001）。与对照组相比，接种LV10-CAPZA1SMMC-7721细胞组裸鼠肝脏上的肿瘤病灶数目明显较多（P=0.0435），接种LV8-CAPZA1MHCCLM3细胞组裸鼠肝脏上的肿瘤病灶数目明显较少（P=0.0399）。<br>　　结论：1.肝癌组织中HIF-1α、PIP2和CAPZA1的表达与HCC的侵袭转移和患者预后密切相关。HIF-1α和PIP2高表达可促进HCC的恶性进展并导致患者预后差；CAPZA1低表达可通过正向调控EMT促进HCC侵袭转移。相关分析显示：HIF-1α的表达与PIP2水平呈正相关，HIF-1α和PIP2与CAPZA1的表达均无线性相关性，提示缺氧可能通过其效应因子HIF-1α诱导PIP2的合成，进而促进HCC侵袭转移。但CAPZA1的表达不受HIF-1α和PIP2的调控，提示它们之间可能存在其他调控机制。<br>　　2.缺氧可通过激活HIF-1α/RhoA/ROCK1信号通路促进PIP2在肝癌细胞膜上的合成，进而诱导肌动蛋白丝细胞骨架重塑，阻断PIP2的合成可抑制肌动蛋白丝细胞骨架的重塑。<br>　　3.PIP2与CAPZA1结合并相互作用，使CAPZA1从F-actin的正极脱落，开放F-actin正极，并促进其不断聚合延长，从而驱动EMT及细胞运动，增强肝癌细胞的侵袭和迁移能力。但PIP2与CAPZA1的相互作用机制阐释不够透彻。推测PIP2可能通过与CAPZA1结合改变了CAPZA1的分子构象，从而导致CAPZA1失去与F-actin正极结合的能力。相关研究工作有待后续深入推进。<br>　　4.阻断HIF-1α/RhoA/ROCK1/PIP2/CAPZA1信号通路可抑制裸鼠肝脏原位移植癌的侵袭转移。<br>　　本研究通过深入探讨HIF-1α/RhoA/ROCK通路对肝癌细胞PIP2水平的影响及PIP2对CAPZA1的调控机制，首次提出并证实缺氧可通HIF-1α/RhoA/ROCK/PIP2/CAPZA1途径调控肌动蛋白丝细胞骨架重塑，进而促进肝癌细胞侵袭转移的研究假说，进一步丰富了HCC侵袭转移机制研究的理论宝库，并为临床HCC侵袭转移的防治提供了新的潜在靶点。