胶质母细胞瘤中组织因子表达调控与血流动力学磁共振特征研究-论文-万方医学网

胶质母细胞瘤中组织因子表达调控与血流动力学磁共振特征研究

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摘要目的: 　　组织因子（tissue factor，TF）是一种长度为47KDa的跨膜糖蛋白，在生理状态下是人体外源性凝血系统的启动因子。研究表明，在多种肿瘤中，TF通过改变早期肿瘤细胞休眠状态导致基因组改变，在肿瘤发生早期发挥重要作用[1]；TF-VIIa复合体活化蛋白酶激活受体(protease activated receptor,PAR)，激活PAR2通路，加速肿瘤细胞的增殖、分化[2]；同时，PAR通路激活和肿瘤内部的高凝状态引起血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和白介素8（interleukin-8）的产生，造成大量新生血管形成[3]，加剧肿瘤恶性程度；此外，血管结构和凝血功能改变是多种恶性肿瘤生长和转移的重要特征[4]，而TF在这个过程中发挥了重要作用[5]。 　　在胶质瘤中，TF表达量与胶质瘤的恶性程度及肿瘤分级相关，在I-II级胶质瘤中，TF阳性表达率约为10%，而在胶质母细胞瘤（IV级）中阳性率高达95%[6]。胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）是高度恶性的中枢神经系统肿瘤，其内部存在大量新生血管，目前，临床治疗方法主要依靠手术切除后联合放化疗及抗血管生成治疗等综合治疗方案，但是患者预后仍然较差，中位生存期仅为14.6个月[7]。而TF表达水平直接影响抗血管治疗的疗效和患者预后[77]。 　　抗TF治疗后，肿瘤生长减缓、新生血管减少、侵袭性减弱，因此，抗TF治疗成为GBM治疗的新靶点[8]。TF作为血管内外源性凝血途径的关键因子，其主要功能与血管及凝血密切相关，因此，探讨其对GBM生存期的影响，研究其表达调控网络中的关键基因，进一步揭示GBM分子特征，为GBM制定更加精准的个性化治疗方案，提高治疗疗效，减少药物副反应，延长GBM生存期具有重要意义。 　　磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）已广泛运用于包括胶质瘤在内的各种颅内肿瘤的临床诊断、监测中，包含血流动力学磁共振参数的多模态磁共振成像能够反映GBM形态、血管功能和代谢变化等信息，同时也能够反映多种影响胶质瘤预后的特征性分子（IDH、MGMT、Ki-67等）[9,10]，但是对于评估TF表达水平的研究还仅限于有创的病理学检查[11]、昂贵且复杂的靶向PET成像或单一参数的磁共振成像[12,77]，因此，利用临床常用的血流动力学磁共振参数活体、无创、动态评价GBM内TF表达水平，能够为GBM的临床诊断、个性化治疗方案的制定和疗效及预后评估提供重要的分子信息，具有重要的临床意义。 　　方法: 　　一、组织因子对胶质母细胞瘤生存期的影响。 　　1.1GBM生存期数据来源于TCGA（the cancer genome atlas）数据库，PROGgeneV2在线基因-生存曲线分析工具，获取TF表达量与GBM生存时间的关系。 　　1.2shRNA抑制U87细胞TF表达，MTT法观察抑制TF表达后细胞生长、增殖变化。 　　1.3将10只裸鼠随机编入U87组和TF抑制组，每组5只，分别将U87细胞和shRNA抑制TF表达的U87肿瘤细胞移植到两组小鼠右侧基底节区，观察并记录荷瘤鼠生存时间。 　　二、组织因子表达调控研究。 　　2.1下载TCGA（https://www.cancer.gov）数据库中GBM数据。 　　2.2利用Sangerbox分析工具、R语言limma包获取差异表达基因并绘制火山图。 　　2.3R语言edgeR包筛选与TF协同/拮抗表达基因，并获取相关系数。 　　2.4登陆GEPIA网站（http://gepia.cancer-pku.cn），查询与TF相似表达基因，根据P值筛选前二十位基因。 　　2.5登陆DAVID网站（https://david.ncifcrf.gov/），输入对TF协同、拮抗和相似表达表达前二十位基因分别进行GO（Gene ontology）分析。 　　2.6R语言ggplot2、GOplot及digest包对P值小于0.05的基因进行可视化分析。 　　2.7登陆cBioPortal网站（https://www.cbioportal.org）对TF调控网络进行分析。 　　2.8对TF调控基因进行功能注释，选取肿瘤病理过程相关基因。 　　2.9合成筛选基因siRNA，转染U87细胞，抑制各基因表达，Western-blot检测抑制各基因表达后TF表达变化。 　　2.10免疫组化法回顾性分析60例GBM患者肿瘤组织中筛选基因与TF表达。 　　三、血流动力学磁共振参数评价胶质母细胞瘤中组织因子表达水平的价值。 　　3.1回顾性分析具有病理资料的60例GBM患者，收集术前常规磁共振扫描、增强磁共振扫描和至少一种灌注磁共振扫描（DCE-MRI或DSC-MRI）序列图像。 　　3.23Dslicer对增强扫描图像中肿瘤强化、坏死、水肿区域进行分割，三维重建并计算得到各区域体积及表面积、坏死比和表面规律性SR。 　　3.3Siemens Syngo工作站对DSC图像进行处理并绘制伪彩图，选取多个层面，采用热点法选取多个ROI，得到肿瘤区域及健侧脑白质脑血容量（cerebral blood volume,CBV）和脑血流量（cerebral blood flow,CBF）值，计算各ROI的相对脑血容量(relative cerebral blood volume,rCBV）和相对脑血流量（relative cerebral blood flow,rCBF）值。 　　3.4Omni Kinetics工作站对DCE-MRI图像进行处理得到容量转移常数Ktrans伪彩图，选取多个层面，热点法选取多个ROI，计算得到Ktrans平均值。 　　3.5术后病理组织切片进行免疫组化染色，Image-pro plus软件对阳性染色区域进行勾划获得阳性染色区域分光密度值（integral optical density,IOD）和面积，计算得到平均分光密度值（mean optical density,MOD）。 　　四、统计学方法 　　采用SPSS25统计软件，对计量资料的表示为平均值±标准差，生存期数据的表示为中位值±标准差，两组间均值比较采用t检验，多组数据间均值比较为单因素方差分析，两组间比较为LSD检验，各组间相关性为Spearman及Pearson相关性分析。受试者工作曲线ROC分析各参数的诊断效能及联合诊断效能。P＜0.05时，差异有统计学意义。 　　结果: 　　一、组织因子对胶质母细胞瘤生存期的影响。 　　1.1TCGA数据库中TF高表达组GBM患者平均生存期为4.4月，低表达组患者平均无进展生存期为14.6个月（P=0.000）。 　　1.2利用shRNA抑制TF表达后，TF抑制组细胞在490mm波长的吸光度值A=0.33±0.03，U87对照组A=0.38±0.21，空病毒对照组A=0.39±0.21，抑制组U87细胞生长、增殖明显减缓，抑制率约27%。 　　1.3U87细胞荷瘤裸鼠生存期为33天，TF抑制组裸鼠生存期为41天，TF抑制组裸鼠生存期明显长于对照组（P＜0.05,P=0.027）。 　　二、胶质母细胞瘤中组织因子表达调控研究。 　　2.1在与TF协同表达的前20位基因中，14个term P值小于0.05，GOterm主要为神经系统结构和发育相关子集。 　　2.2前二十位的负相关基因进行GO，5个term P值小于0.05，血管生成与神经系统发育排在前列。 　　2.3与TF相似表达前二十位基因中7个term P值小于0.05，主要是神经系统发育和干细胞调节相关的功能子集。 　　2.4与TF、协同、拮抗及相似表达前二十位基因中肿瘤相关基因均不在TF表达调控网络中，而该网络中，SERPINC1、MAPK14和GJA1基因与凝血、细胞增殖或信号转导功能相关。 　　2.5siRNA分别抑制SERPINC1、MAPK14和GJA1基因表达后，TF表达抑制约6.3%，0.3%，27.3%。 　　2.6免疫组化组化结果显示，GJA1表达量与TF表达量相关（r=0.423,P=0.001） 　　三、血流动力学磁共振参数评价胶质母细胞瘤中组织因子表达水平的价值。 　　3.1TF高表达组的坏死比、Ktrans、rCBV、rCBF均高于低表达组。坏死比、Ktrans值、rCBV值、rCBF值与TF表达量呈正相关（r=0.665，P=0.000；r=0.631,P=0.000；r=0.661，P=0.000；r=0.619，P=0.000)。 　　3.2ROC曲线分析各血流动力学磁共振参数均有较好反映TF表达量的价值，rCBF的AUC达到0.907，截断值为0.889，0.857，坏死比为0.869（0.846，0.676），Ktrans0.854（0.813，0.833），rCBV0.804（0.944，0.571）。常规磁共振与灌注磁共振参数联合运用对TF表达量反映能力更好，坏死比&Ktrans0.982（1，0.875），坏死比&rCBV0.939（0.889，0.905），坏死比&rCBF0.971（0.944，0.857）。 　　结论: 　　1.原发性GBM中TF表达水平对于患者生存期具有重要影响，TF高表达患者生存期低于低表达组，抑制TF表达可延长GBM生存期，TF可以作为GBM生存期的预测因子。 　　2.TF表达水平可以影响U87细胞增殖速度，抑制U87细胞内TF表达能够显著抑制肿瘤细胞的生长、增殖。 　　3.在TF表达相关及调控基因中，SERPINC1、MAPK14和GJA1基因参与TF表达调控，其主要功能与细胞信号转导、细胞周期等相关，抑制其表达后，TF表达量降低，是TF表达调控的关键基因，其中，GJA1是TF表达调控中最显著的基因。 　　4.常规增强磁共振参数坏死比及灌注磁共振扫描参数Ktrans、rCBV和rCBF能够较好地反映GBM患者肿瘤内TF表达，可作为GBM中TF表达量的MRI影像学标志物，血流动力学磁共振成像参数尤其是多种成像参数联合运用在评价GBM内TF表达水平中具有较高的运用价值。