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摘要研究目的:<br>　　胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是中枢神经系统高度血管化的恶性肿瘤，其具有进展迅速、侵袭度高、易复发等特征。针对血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）的重组人源性单克隆抗体贝伐单抗（bevacizumab,BEV）是首批用于胶质母细胞瘤抗血管生成的药物。然而，研究发现GBM患者抗血管生成治疗效果短暂，且极易发生治疗抵抗。越来越多的证据显示，抗血管治疗抵抗与GBM缺氧、酸化的肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）密切相关。因此，改善肿瘤微环境对于克服治疗抵抗，显著提高GBM抗血管疗效至关重要。随着纳米医学的进步，基于锰元素的四价态氧化物MnO2的纳米体系受到了越来越多的关注。MnO2能在酸性条件下与肿瘤代谢过程中产生的过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）发生氧化还原反应（MnO2+H2O2+2H+→Mn2++O2+2H2O），生成氧气并释放顺磁性Mn2+，同时实现肿瘤特异激活的磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）及TME的改善，进而增强肿瘤治疗响应。<br>　　然而，尽管MnO2具有优良的理化特性和巨大的应用潜力，但既往文献显示，MnO2纳米体系发生氧化还原反应所需的最适pH值大都在6.5及以下，而肿瘤的弱酸性微环境pH值多在6.5-7.0范围，因此，传统MnO2纳米体系可能面临TME响应速度较慢、MRI诊断成像不及时的劣势，难以满足临床快速灵敏的成像需求。锰元素作为一种具备多种价态的过渡金属元素，其可变价态很多，理化性质相对不稳定的Mn(Ⅲ)价态易在弱酸性条件下发生pH依赖的歧化反应生成Mn2+（2Mn3+→Mn2++Mn4+），受到了越来越多的关注。为实现TME的响应增强，本研究利用生物矿化的方法制备独特的Mn(Ⅲ)及Mn(Ⅳ)双价态的锰基纳米体系RGD-BMnNPs，并利用其装载Cy5荧光染料标记的抗血管生成治疗靶点VEGFA的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA），以期实现TME响应增强的MRI/荧光双模态成像的同时，克服传统单独使用siRNA带来的分布缺乏特异性、易在体内分解以及细胞摄取效率低的缺点，实现颅内胶质瘤高效的VEGFA-siRNA递送及TME综合改善下抗血管治疗的增强，为临床胶质瘤诊断及治疗提供全新的纳米体系设计思路。<br>　　研究方法:<br>　　1．两步法制备RGD-BMnNPs：第一步，利用BSA独特的巯基活性位点，将RGD短肽修饰于BSA表面形成复合物RGD-BSA。第二步，以RGD-BSA作为反应的框架和稳定剂，通过生物矿化的方法，在碱性条件下制备Mn(Ⅲ)及Mn(Ⅳ)双价态RGD-BMnNPs纳米体系，观察RGD-BMnNPs的形貌并测试其水合尺寸以及锰元素含量。<br>　　2．RGD-BMnNPs不同环境条件下价态组成及驰豫率测试。利用X光电射线能谱（XPS）测试RGD-BMnNPs在生理环境及肿瘤弱酸微环境中锰元素的价态组成。采用7.0T小动物磁共振测试RGD-BMnNPs纳米体系在pH=6.5-7.4环境中驰豫率r1值并进行对比分析。<br>　　3．对照组MnO2纳米颗粒的制备表征及与RGD-BMnNPs对比。采用一步法在水相中制备MnO2纳米颗粒，观察其形貌，并测量其中锰元素含量。采用X射线衍射仪（XRD）验证晶体成分，采用7.0T小动物磁共振测试MnO2纳米颗粒在pH=6.5-7.4环境中r1值，并和RGD-BMnNPs进行对比。<br>　　4．RGD-BMnNPs装载VEGFA-siRNA-Cy5效率及表征。采用凝胶电泳法检测RGD-BMnNPs装载VEGFA-siRNA-Cy5能力及两者最佳投入比例，通过全波长酶标仪分析装载VEGFA-siRNA-Cy5前后紫外-可见光（UV-vis）吸收光谱，采用活体荧光仪及发射波谱（Ex=650nm）观察装载前后荧光强度改变，采用动态光散射粒径仪（DLS）检测装载前后水合粒径及zeta电位改变。<br>　　5．RGD-BMnNPs/VEGFA-siRNA-Cy5体外细胞实验。将胶质母细胞瘤U87MG细胞分别与VEGFA-siRNA-Cy5、RGD-BMnNPs及RGD-BMnNPs/VEGFA-siRNA-Cy5共孵育，通过共聚焦显微镜观察细胞荧光成像效果。采用标准CCk-8实验检测RGD-BMnNPs/VEGFA-siRNA-Cy5纳米复合物细胞毒性。<br>　　6．RGD-BMnNPs/VEGFA-siRNA-Cy5体内诊疗效果评估。采用SPF级Balb/c裸鼠建立颅内原位U87MG胶质母细胞瘤模型，尾静脉注射纳米复合物后在不同时间点采用7.0T小动物磁共振检测肿瘤区域T1信号改变，采用小动物活体成像仪监测不同时间点肿瘤区域荧光强度改变，并采用脑组织速冻切片在荧光显微镜下观察肿瘤区域的荧光颗粒。每周3次裸鼠尾静脉注射纳米复合物，记录并对比治疗及对照组小鼠生存期。通过免疫蛋白印迹法检测不同时间点治疗及对照组肿瘤组织血管内皮生长因子（VEGFA）以及缺氧诱导因子（HIF-1α）、乳酸脱氢酶（LDH-A）表达改变，分别对治疗及对照组肿瘤组织连续切片并行H&E及免疫组化染色，利用Image Pro Plus6.0软件测量肿瘤微血管面积及直径，并进行对比分析。<br>　　研究结果:<br>　　1．通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）证明BSA成功修饰RGD短肽，以RGD-BSA作为模板，通过生物矿化的方法成功合成RGD-BMnNPs。RGD-BMnNPs呈不规则的具有高比表面积的片状结构，分布均匀，能谱分析结果显示纳米体系中存在以C、Mn为主的多种元素，水合粒径为71.8±25.0nm，与电镜测量结果相符，ICP-MS检测RGD-BMnNPs锰含量为4mM。<br>　　2．生理pH=7.4条件下RGD-BMnNPs具备Mn(Ⅲ)及Mn(Ⅳ)两种价态，且两者比例约为1∶1。弱酸pH=6.5条件下纳米体系中Mn(Ⅲ)转变为Mn(Ⅱ)，体系存在Mn(Ⅱ)及Mn(Ⅳ)两种价态；此时加入H2O2后Mn(Ⅳ)参与反应，体系仅存在Mn(Ⅱ)一种价态。RGD-BMnNPs在生理pH下仅有较低的驰豫率，其r1=0.81mM-1s-1；在弱酸性条件下，驰豫性能增强，pH=6.9及6.5时，r1分别为1.53mM-1s-1和2.25mM-1s-1；而当在pH=6.5条件下加入H2O2完全反应后，驰豫性能显著增强，r1=4.56mM-1s-1。<br>　　3．MnO2纳米颗粒呈球型，XRD结果中两个衍射峰为37°和66°，分别对应(101)和(002)证明晶体为MnO2。与RGD-BMnNPs相比，MnO2纳米颗粒在不具备H2O2时不能响应弱酸环境产生Mn2+成像，而在具备H2O2时，r1=1.33mM-1s-1（pH=6.5）低于RGD-BMnNPs驰豫性能（r1=4.56mM-1s-1）。<br>　　4．凝胶电泳实验结果显示RGD-BMnNPs与VEGFA-siRNA-Cy5投入质量比为10∶1时，纳米体系可完全装载siRNA，UV-vis吸收光谱显示在600-700nm范围内出现强烈的吸收带，而648nm处吸光值可用来对RGD-BMnNPs装载的siRNA浓度进行定量评价。装载siRNA后纳米体系呈现Cy5典型的荧光特征，平均水合尺寸为80.5±30.1nm，zeta电位为-7.16±0.6mV。<br>　　5．RGD-BMnNPs/VEGFA-siRNA-Cy5细胞共孵育实验组与VEGFA-siRNA-Cy5及RGD-BMnNPs细胞共孵育实验组相比，呈现强烈的Cy5红色荧光，证明纳米体系高效的细胞递送siRNA能力。CCK-8检测纳米复合物细胞毒性，各梯度浓度组未见明显差异，证明其良好的生物相容性。<br>　　6．由于独特肿瘤微环境响应增强的纳米体系设计，颅内原位胶质瘤在注射30分钟后即出现明显的T1信号增强，强化持续达180分钟。活体荧光可见小鼠颅内肿瘤特异性的红色荧光聚集，其在30分钟达到最强并逐渐减低，脑组织速冻组织切片发现红色的荧光颗粒存在于肿瘤组织，再次证明了纳米体系高效的siRNA体内递送能力。纳米复合物治疗后荷瘤小鼠生存时间延长，不同时间点治疗组中VEGFA、HIF-1α、LDH-A表达及肿瘤微血管面积、直径均低于对照组，表明TME综合改善下的良好的抗血管治疗效果。<br>　　研究结论:<br>　　1．成功制备了具有Mn(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)双价态的TME响应增强的纳米体系RGD-BMnNPs，其能迅速响应弱酸微环境，弥补Mn(Ⅳ)纳米颗粒的不足,促进其转换应用。<br>　　2．RGD-BMnNPs呈纳米片状结构，具有极高的比表面和良好的生物相容性，可通过物理吸附作用高效装载小分子物质，实现体外细胞及颅内肿瘤VEGFA-siRNA-Cy5的高效递送。<br>　　3．通过RGD-BMnNPs实现TME缺氧、酸化及高H2O2的综合改善，增强了抗肿瘤血管生成的治疗效果，延长了荷瘤小鼠的生存时间，为临床胶质瘤的诊疗提供了全新的视角。