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摘要目的：<br>　　牙周炎是牙周致病菌感染从而影响牙周组织，包括硬组织（牙骨质和骨）和软组织（牙周韧带和牙龈）的一类慢性炎症性破坏性疾病，其典型的病理特征是牙槽骨的不可逆吸收破坏，并最终导致牙齿松动和脱落，严重影响口腔乃至全身健康。近来研究发现机体氧化应激（oxidative stress，OS）水平升高是牙周炎发生发展的重要机制之一。因此，开发新型高效低毒的抗氧化剂对于牙周炎的防治具有良好的临床应用前景。<br>　　姜黄素是从姜科植物，如姜黄等提取的一种药食同源的天然抗氧化剂，在牙周炎的抗氧化治疗中被证实具有临床应用价值和意义。然而，由于姜黄素分子结构中的β-二酮结构不稳定，导致其活性降低，极大地限制了成药性。为此，以姜黄素作为先导化合物，将其β-二酮结构改构为单酮，成为提高其稳定性的一个重要途径。本研究首先设计和合成了一系列不同骨架的单羰基姜黄素类似物（mono-carbonyl analogues of curcumin，MCACs），系统筛选出两个毒性极小的骨架类型。在此基础上进一步设计和合成了两个骨架的系列类似物，抗氧化活性筛选后优选其中一种活性化合物进行体外活性与初步机制的研究，以期得到活性强和毒性低的抗氧化剂。最后加以验证其治疗大鼠牙周炎模型的效果，为进一步获取临床治疗牙周炎的候选药物提供实验依据与理论基础。<br>　　方法：<br>　　第一部分：单羰基姜黄素类似物设计、合成、体外抗氧化活性及初步机制研究<br>　　将姜黄素结构中的β-二酮结构改构为单羰基，设计得到包括含环戊酮、哌啶酮、吡喃酮等14种不同桥接酮的MCACs骨架（本论文所有化合物均由温州医科大学药学院吴建章教授实验室合成）。以姜黄素作为阳性对照药物，通过MTT法进行细胞活力筛选，获得对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1细胞）无明显生长抑制作用的骨架类型。优选两种低毒的骨架，在该骨架基础上设计20个类似物。MTT法测定前述20个化合物对双氧水（H2O2）诱导的MC3T3-E1细胞氧化应激损伤的保护作用，筛选得到具有抗氧化应激作用的活性化合物。<br>　　1.姜黄素类似物的设计、合成与筛选<br>　　2.人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）的原代培养<br>　　收集因阻生原因而拔除的第三磨牙，采用酶消化结合组织块法培养hPDLCs后并鉴定其来源。<br>　　3.活性化合物抗氧化的活性研究<br>　　MTT法检测不同浓度、不同预孵育时间的活性化合物对MC3T3-E1细胞和hPDLCs的氧化保护作用。在MC3T3-E1细胞中进一步通过倒置显微镜观察活性化合物预孵育对氧化应激模型中细胞形态的影响。脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒和荧光探针分别探讨活性化合物预孵育对氧化应激模型中MC3T3-E1细胞内MDA水平以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成的影响。<br>　　4.活性化合物抗氧化的初步机制研究<br>　　基于前期良好抗氧化应激活性的活性化合物，进一步探讨其作用机制。首先，免疫荧光染色法和western blotting分别观察活性化合物对细胞抗氧化信号通路中核因子E2相关因子2（nuclear respiratory factor-2，Nrf2）核转位以及血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白生成的影响；其次，比较siRNA沉默Nrf2基因前后，活性化合物预孵育对HO-1蛋白表达和氧化保护作用影响的差异。第二部分：单羰基姜黄素类似物活性化合物治疗大鼠牙周炎及初步机制研究<br>　　构建大鼠牙周炎模型，分组如下：正常组、牙周炎组以及活性化合物组。活性化合物组灌胃给药4周（牙周炎造模之前持续2周，造模后持续2周）。通过体式显微镜观察比较各组大鼠的牙槽骨吸收量；进一步通过micro-CT明确各组大鼠的牙槽骨吸收情况以及骨体积分数（BV/TV）；HE染色评价大鼠的牙槽骨吸收与牙周组织炎症细胞浸润程度；免疫组化检测大鼠牙周组织中HO-1、Nrf2、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukine-1beta，IL-1β）的蛋白表达。<br>　　结果:<br>　　1.姜黄素在20μmol/L和60μmol/L浓度下对MC3T3-E1细胞生长抑制率分别为50%和60%，桥接酮为环戊酮（A组）和吡喃酮（H组）的MCACs骨架在浓度高达60μmol/L时对MC3T3-E1细胞生长无明显抑制作用。抗氧化应激活性筛选显示，具有邻二羟基的类似物1A和1H具有较好的抗氧化活性，进一步优选出最优活性化合物1A进行后续研究。<br>　　2.免疫细胞化学染色表明细胞符合中胚层来源特征，成功培养出hPDLCs。<br>　　3.预孵育1h或18h后，不同浓度的活性化合物1A（1.25、2.5、5、7.5μmol/L），均可显著增加氧化应激模型中MC3T3-E1细胞和hPDLCs存活率（p＜0.05）。预孵育1h或18h后，不同浓度的1A（2.5、5、7.5μmol/L）可降低MC3T3-E1细胞的MDA水平（p＜0.05）。7.5μmol/L浓度的1A可降低MC3T3-E1细胞的ROS生成，并维持细胞的正常形态。<br>　　4.与二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）组及阳性对照组相比，活性化合物1A组细胞的细胞核中显示出更强的Nrf2荧光信号，表明1A促进Nrf2核转移。此外，1A以剂量依赖性的方式上调HO-1的蛋白表达，且在5μmol/L浓度时，1A的上调作用较阳性对照药更强。在沉默Nrf2基因的表达后，1A促进HO-1表达的能力显著减弱，且1A预孵育后该组的细胞存活率较未沉默组明显下降（p＜0.01）。<br>　　5.与大鼠牙周炎模型组相比，1A组的大鼠牙槽骨吸收量明显下降（p＜0.01），骨体积分数（BV/TV）有显著提高（p＜0.01）；1A组的大鼠牙周组织炎症细胞浸润减少，牙龈形态更为完整，HO-1、Nrf2的蛋白表达显著增多（p＜0.01），TNF-α、IL-1β的蛋白表达明显减少（p＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.通过结构改造与筛选，得到了理想的姜黄素类似物活性化合物1A，可通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥较好的抗氧化保护作用。<br>　　2.活性化合物1A通过抗氧化和抗炎作用对大鼠牙周炎表现出显著的防治效果，对于牙周炎的治疗具有良好的潜在价值和意义。