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摘要目的：<br>　　Ph染色体阴性的经典骨髓增殖性肿瘤(MPN)以红系、粒系和巨核系中一系或多系髓细胞过度增殖为主要特征，是一种恶性血液肿瘤疾病。临床上主要以真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)多见。目前，研究证实MPN的主要分子病因包括JAK2、MPL和CALR基因突变，在MPN疾病中相互排斥发生。其中，JAK2基因突变见于95%的PV患者，突变类型主要为JAK2V617F和JAK2exon12。MPLW515是最常见的MPL基因突变类型，仅见于1%-10%的ET和PMF患者。CALR基因的突变热点位于9号外显子，主要表现为两种突变类型(52-bp缺失和5-bp插入)，主要见于ET和PMF患者。其余未检测到上述三种驱动基因主要热点突变的MPN称为“三阴性”MPN(TN-MPN)，主要见于15%的ET和低于10%的PMF患者。近年来，研究者在少数MPN患者中发现了驱动基因双突变的患者，以JAK2V617F和CALR基因共突变多见，可见于PV、ET及PMF患者。临床工作中我们首次发现JAK2exon12(JAK2N533S不典型突变)和CALR(52-bp缺失)基因共突变的一例ET患者。到目前，几乎所有的JAK2exon12突变主要导致PV的发生，几乎没有致ET和PMF患者的报道。然而，我们收集的该例患者仅有ET表型的临床特征而缺乏PV表型，无法解释JAK2exon12(JAK2N533S不典型突变)克隆细胞为何未发生PV表型。本研究拟对该例患者进行JAK2N533S和CALRtype1型(52-bp缺失)共突变的克隆关系分析以及JAK2N533S突变促细胞自主增殖功能进行分析，以期阐明该患者ET发生的机制，亦为增加我们对MPN驱动突变基因功能机制的认识。<br>　　方法：<br>　　1.临床水平分析患者JAK2N533S和CALRtypeⅠ型共突变的克隆关系<br>　　根据赫尔辛基宣言，该患者已签署书面知情同意书。提取患者新鲜外周血单个核细胞并稀释制备单细胞悬液(1×102cells/mL)，用有限稀释法培养获取单细胞克隆，挑取单细胞克隆，分别用含3U/mlrhEPO和100ng/mlrhG-CSF的甲基纤维素培养基培养单细胞克隆15天，诱导形成红系集落(BFU-E)和粒系集落(CFU-G)；提取单个红系和粒系集落的DNA，用相应引物对JAK2exon12和CALRexon9进行PCR扩增，然后取扩增产物测序，对测序结果进行分析。<br>　　2、细胞水平分析JAK2N533S突变基因的促细胞自主增殖功能<br>　　构建JAK2N533S及其对照基因的慢病毒表达载体，通过慢病毒表达系统将JAK2N533S及其对照基因转入BaF3细胞，建立稳定表达各载体的BaF3细胞模型；用细胞增殖试剂盒(CCK-8)检测各组BaF3细胞在无IL-3条件下0-5天内的增殖情况，并统计分析。收集JAK2N533S及其对照基因各组的BaF3细胞，提取各组细胞总蛋白并进行蛋白定量，SimpleWestern法分析各组磷酸化STAT3、STAT5和非磷酸化STAT3、STAT5蛋白表达水平。<br>　　结果：<br>　　1、本例患者初诊时的相关临床资料<br>　　该患者为75岁女性患者，以“3年来血小板逐渐增多”就诊我院，无脾大、出血、血栓形成等临床表现。血常规检查：血小板707×109/L，白细胞6.8×109/L，红细胞4.26×1012/L，血红蛋白132g/L；血生化：乳酸脱氢酶297U/L；骨髓象：骨髓细胞中红系及粒系形态及比例正常，巨核细胞数量明显增多；骨髓组织活检显示：巨核细胞明显增生，无明显纤维化；染色体核型分析显示：46，XX(20个中期细胞)；MPN相关基因突变检测：JAK2exon12(JAK2 N533S)和CALR突变(CALR type1)阳性。综合上述检查结果，初步诊断该患者为ET。<br>　　2、本例患者BFU-E和CFU-G集落JAK2N533S和CALRtype1型突变克隆演变分析<br>　　①显微镜下挑取的17个单个红系集落，经检测全部携带JAK2N533S杂合突变，14个(82%)集落携带CALRtype1杂合突变，2个(12%)集落为CALR野生型，1个(6%)集落检测到CALRtype1纯合突变。<br>　　②挑取的21个单个粒系集落，经检测均存在JAK2N533S杂合突变，20个(95%)集落携带CALRtype1杂合突变，1个(5%)集落为CALR野生型。<br>　　③由于所有集落中均检测出JAK2N533S杂合突变，我们推测该突变可能是胚系突变。因此，我们对该患者的毛囊DNA中JAK2N533S及CALR突变进行检测，结果发现JAK2N533S杂合突变仍为阳性，而CALR基因为野生型，从而验证了JAK2N533S突变为胚系突变。<br>　　3、JAK2N533S及其对照基因(JAK2 WT，JAK2 K539L、JAK2N542-543del)的功能分析<br>　　①各组Ba/F3细胞模型增殖能力分析与比较<br>　　采用CCK-8法检测各组在无IL-3条件下0-5天内Ba/F3细胞的增殖情况，结果显示JAK2N533S组和阴性对照各组细胞(JAK2WT组、MSCV组及Ba/F3组)均未出现明显的细胞增殖，各组间细胞数无显著差异(P>0.05)；JAK2N533S与阳性各对照组(JAK2K539L组和JAK2N542-543del组)相比，差异有统计学意义(P<0.001)上述结果提示JAK2N533S突变无促细胞增殖的作用。<br>　　②各组Ba/F3细胞模型JAK2/STAT信号转导通路活化情况<br>　　在无IL-3的情况下培养48h后进行SimpleWestern法分析，发现JAK2K539L组和JAK2N542-543del组作为阳性对照组，磷酸化STAT5(tyr694)和STAT3(tyr705)表达水平明显增加，而JAK2N533S组与阴性对照各组(JAK2WT组、MSCV组和Ba/F3组)，STAT5和STAT3蛋白磷酸化水平均无明显表达，提示JAK2N533S突变并不能改变JAK2蛋白的功能激活JAK2/STAT通路。<br>　　结论：<br>　　我们发现一例JAK2exon12(N533S)和CALRtype1共突变的ET患者。克隆分析毛囊基因检测结果证实JAK2exon12(N533S)不典型突变为胚系突变，CALRtype1为后天获得性突变。细胞功能研究证实JAK2胚系不典型突变(JAK2 N533S)不具有自主促细胞增殖的作用。综上提示患者携带的JAK2exon12(N533S)突变不具有产生PV表型的能力，而其ET表型则由后期获得性的CALRtype1突变所致。