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摘要第一部分<br>　　I型成骨不全症一家系COL1A1基因新剪接突变c.3814+1G＞T的致病性研究<br>　　目的：<br>　　本部分研究基因COL1A1上一个新的剪接突变在I型成骨不全症家系中的致病性，从而揭示这个家系的致病基因、遗传模式，为该家系以后产前诊疗提供依据。<br>　　方法：<br>　　本研究经山西医科大学第二医院伦理委员会批准收集来自山西医科大学第二医院I型成骨不全先证者及其家系共八名成员外周血液样本，其中有三个人患病和五人正常。该家系患者共同特征为巩膜淡蓝色，身高正常或稍矮。运用全外显子组测序，生信分析，普通PCR和Sanger测序，Minigene，实时荧光定量PCR(qPCR)，反转录PCR(RT-PCR)和Western-blot进行新的突变致病性研究。<br>　　结果：<br>　　1.WES检测先证者的外周血样本，经生信分析，得到COL1A1新的剪接突变c.3814+1G＞T。<br>　　2.采用Sanger法验证COL1A1c.3814+1G＞T在该家系中的携带情况，三名患者携带该突变，而四名正常家系成员不携带该突变，符合家系共分离原则。<br>　　3.病人血液中COL1A1基因mRNA的表达量差异，RT-qPCR结果显示：家系正常成员作对照，患者体内COL1A1基因的表达量下调。<br>　　4.采用MaxEntScan(MES)，HumanSplicingFinder和Spliceman软件进行生信分析预测该剪接位点的致病性，结果表示这个剪接突变位点具有致病性。<br>　　5.Mminigene结果显示新的剪接突变造成来自Intron48的132bp插入到Exon48和Exon49之间，插入的内含子中有终止密码子。<br>　　6.Westernblot结果表明，突变体导致细胞产生一条截断蛋白。<br>　　7.同源序列保守分析表明COL1A1基因新的突变位点位于多物种进化比较重要的保守区域；COL1A1c.3814+1G＞T(p.Gly1272Valfs * 6)突变导致其编码的I型胶原蛋白前α链羧基端丢失，从而影响I型胶原蛋白的合成。<br>　　结论：<br>　　运用全外显子测序技术和一系列细胞分子生物学技术证实COL1A1新的剪接突变c.3814+1G＞T是这个I型成骨不全家系的致病突变。<br>　　第二部分<br>　　一个无虹膜家系PAX6基因新的剪接突变c.682+2T＞C致病性研究<br>　　目的：<br>　　本部分研究一个无虹膜家系中PAX6一个新的剪接突变的致病机制。<br>　　方法：<br>　　本研究经山西医科大学第二医院伦理委员会批准，采集该家系五名成员外周血液样本，其中有患者和三人正常。运用全外显子组测序技术，生信分析，聚合酶链式反应(PCR)和Sanger测序，荧光定量PCR(qPCR)，Minigene，逆转录PCR(RT-PCR)和Western-blot、免疫荧光以及靶基因检测进行新突变致病性研究。<br>　　结果：<br>　　1.WES检测先证者的外周血样本，经生信分析，得到PAX6基因c.682+2T＞C(p.E227＞G)这一新的剪接突变。<br>　　2.采用Sanger测序验证PAX6c.682+2T＞C在该家系中的携带情况，结果显示两名患者携带c.682+2T＞C，而三名正常家系成员没有c.682+2T＞C，符合家系共分离原则。<br>　　3.荧光定量PCR技术检测基因突变后体内mRNA的表达量，与野生型相比，新的突变不会影响患者体内mRNA的正常表达。<br>　　4.利用RT-PCR技术检测到患者体内除正常转录本外，还存在异常条带，经一代测序比对分析，异常条带为Exon8和Exon9之间插入39bp的8号内含子。<br>　　5.利用minigene技术体外模拟患者体内转录情况，分别在mRNA水平及蛋白水平证明这个c.682+2T＞C突变是导致mRNA前体剪接异常，会产生转录本异常。<br>　　6.同源序列保守分析表明PAX6基因新的突变位点位于多物种进化比较重要的保守区域。<br>　　7.免疫荧光结果显示突变体蛋白表达亚定位和颗粒变化不明显。<br>　　8.PAX6c.682+2T＞C导致下游靶基因ALDH1A1基因表达量下降。<br>　　结论<br>　　运用全外显子测序技术和一系列细胞分子生物学技术证实PAX6基因新剪接突变c.682+2T＞C是这个无虹膜家系的致病突变。