miR-96靶向调节DAL-1及CADM1表达对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响-论文-万方医学网

miR-96靶向调节DAL-1及CADM1表达对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响

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摘要研究背景与目的： 　　肺癌是目前人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(占80%)的5年生存率仅约15%。导致非小细胞肺癌预后差的主要原因是缺乏有效的早期诊断标志物及就诊时多已发生远处转移。因此，寻找用于非小细胞肺癌临床早期诊断的分子标志物及其转移的分子机制，是当前非小细胞肺癌研究的重要任务。本课题组前期工作已证明肺腺癌差异表达因子DAL-1在非小细胞肺癌中具有抑制肿瘤细胞生长和侵袭的作用；采用microRNA.org、TargetScan和PicTar三个常用数据库共同预测到miR-96是DAL-1的上游负调节因子，且DAL-1的结合蛋白CADM1也是miR-96的靶基因。CADM1在肺癌中发挥抑癌基因的作用，DAL-1是CADM1的下游级联基因，CADM1通过4.1结合模体与DAL-1结合才能与肌动蛋白相连接，从而参与细胞运动和信号转导[1]，发挥抑制肿瘤转移的作用。由此推测，若抑制miR-96表达，可以同时解除其对DAL-1和CADM1两个靶基因的表达抑制，使两者对非小细胞肺癌细胞生长和侵袭的抑制产生叠加效应。 　　本研究拟在上述研究的基础上，进一步深入探讨miR-96对DAL-1和CADM1的靶向调控关系及其对非小细胞肺癌转移的影响，以期为非小细胞肺癌的临床预后判定提供新的辅助指标，为其临床基因治疗提供新的靶标。 　　研究方法： 　　1miR-96在非小细胞肺癌中的表达 　　1.1利用数据库分析miR-96在非小细胞肺癌组织和肺癌患者血浆中的表达水平及意义 　　在NCBI的公共数据库GEO中，以“miRNA”、“lungcancer”、“human”为关键词进行检索，选择基因芯片探针平台来源相同、且临床资料完整的4个肺癌的miRNA芯片数据资料包(GSE68951、GSE51855、GSE48414和GSE63805)。利用wilcoxon秩和检验分析miR-96表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤临床分期之间的相关性(GSE48414)，Kruskal-Wallis非参数检验分析miR-96水平与肿瘤组织学分型之间的相关性(GSE51855)。采用spss16.0对4个芯片的数据进行分析，所得数值均以(均值±标准差)表示，利用秩和检验方法分析miR-96在非小细胞肺癌组织(GSE51855：126例非小细胞肺癌组织和5例正常组织；GSE48414：154例肺腺癌组织和20例正常肺组织；GSE63805：32例I期肺腺癌组织和30例配对的癌旁组织)中的表达及意义；利用wilcoxon秩和检验方法分析了miR-96在患者血浆(GSE68951：26例肺癌患者和12例非癌症其他肺部疾病患者)中的表达及意义。 　　1.2qRT-PCR方法检测miR-96在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达 　　利用qRT-PCR检测9对配对的非小细胞肺癌组织和癌旁组织及6株非小肺癌细胞株中miR-96的表达水平。 　　2生物信息学分析miR-96的生物学功能 　　2.1生物信息学预测miR-96靶基因 　　利用miRecords数据库预测miR-96的靶基因，为降低假阳性率，选择被至少6个miRNA靶标预测软件同时预测到的基因作为候选靶基因集合；并检索已有实验数据支持的确切靶基因。 　　2.2miR-96靶基因的功能富集(GO)和信号通路富集分析(KEGG) 　　利用DAVID6.7数据库进行靶基因的GO基因功能聚类分析和KEGG信号通路富集分析。通过FisherExectTest计算P值，以P＜0.05为显著性阈值得到靶基因集合相对于背景具有统计学意义的生物学功能、途径和细胞定位，还有信号转导通路。 　　3miR-96对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 　　3.1构建过表达miR-96和稳定抑制miR-96表达的非小细胞肺癌细胞株 　　选取A549和H460细胞转染表达miR-96的慢病毒和阴性对照病毒，构建2株过表达miR-96的肺癌细胞株及阴性对照细胞；选取A549和H520细胞转染miR-96inhibitor的慢病毒和阴性对照病毒，构建2株稳定抑制miR-96表达的A549和H520细胞株及阴性对照细胞，qRT-PCR检测细胞中miR-96的表达水平，鉴定miR-96过表达、稳定抑制非小细胞肺癌细胞是否构建成功。 　　3.2过表达miR-96对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 　　实验分为6组：A549细胞、A549-NC细胞、A549-miR-96细胞、H460细胞、H460-NC细胞、H460-miR-96细胞组，利用平板克隆形成实验、细胞计数法、划痕实验、Transwell小室实验分别检测miR-96过表达对非小细胞肺癌细胞克隆形成、增殖、迁移及侵袭的影响。 　　回复实验：在上述miR-96过表达细胞感染miR-96inhibitor的慢病毒，并重复上述生物学行为研究。 　　3.3稳定干扰miR-96表达对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 　　实验分为6组：A549细胞、A549-NC细胞、A549-miR-96inhibitor细胞、H520细胞、H520-NC细胞、H520-miR-96inhibitor细胞组。检测方法同3.2。 　　回复实验：在miR-96稳定干扰细胞感染表达miR-96的慢病毒，检测方法同3.2。 　　4miR-96靶基因DAL-1、CADM1的鉴定 　　4.1DAL-1、CADM1在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达情况 　　利用westernblot检测6对配对的非小细胞肺癌组织和癌旁组织及6株非小细胞肺癌细胞株中DAL-1和CADM1的表达水平，并分析miR-96与DAL-1、CADM1表达的关系。 　　4.2miR-96对DAL-1、CADM1表达的调控 　　4.2.1miR-96在293t细胞中对DAL-1、CADM1表达的调控 　　利用miR-96过表达和miR-96inhibitor的慢病毒分别感染293t细胞，构建过表达和稳定抑制miR-96表达的293t细胞，利用Q-PCR和westernblot分别检测过表达和稳定抑制miR-96表达对293t细胞中DAL-1、CADM1mRNA和蛋白表达水平的影响。 　　4.2.2miR-96在非小细胞肺癌细胞株中对DAL-1、CADM1表达的调控 　　利用阳离子脂质体和慢病毒，分别通过瞬时转染和稳定转染的方法在非小细胞肺癌细胞(A549、H460、H520)中过表达和抑制miR-96的表达，利用Q-PCR和westernblot法检测过表达和抑制miR-96表达对非小细胞肺癌细胞中DAL-1、CADM1mRNA和蛋白表达水平的影响。 　　4.3双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-96与DAL-1、CADM1的相互作用构建融合CADM1基因野生型和突变型3’UTR的双荧光素酶报告基因载 　　体，融合DAL-1基因野生型和突变型3’UTR的双荧光素酶报告基因载体前期已构建，应用双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-96与DAL-1、CADM1的相互作用。 　　4.4验证DAL-1与CADM1结合miR-96的过程中是否存在竞争关系 　　实验分为两组：H460细胞组(内源性表达DAL-1、CADM1)和H460-si-CADM1细胞组(利用阳离子脂质体法转染CADM1siRNA至H460细胞，沉默CADM1mRNA表达)，利用qRT-PCR法检测miR-96的表达水平，Q-PCR和westernblot法检测DAL-1mRNA和蛋白表达水平的变化。 　　4.5抑制miR-96表达和过表达DAL-1对非小细胞肺癌细胞生物学行为影响的比较 　　实验分为两组：A549-miR-96inhibitor、A549-DAL-1细胞组，利用平板克隆形成实验、细胞计数法、划痕实验和transwell小室实验分别比较两组细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力。 　　1.4miR-96上游转录因子预测分析 　　4.6miR-96基因的启动子序列 　　利用UCSC和Ensembl两种数据库在线获取miR-96基因的启动子序列；4.7双荧光素酶报告基因系统检测miR-96启动子的转录活性 　　构建融合miR-96启动子序列的miR-96promoter-PGL4.0重组载体，双荧光素酶报告基因系统检测其启动子转录活性。 　　4.8miR-96的上游转录因子预测 　　利用Footer和Consit两个转录因子预测数据库预测miR-96基因的上游转录因子。 　　4.9miR-96上游转录因子的生物信息学分析 　　利用THECANCERGENOMEATLAS数据库检索分析候选转录因子在人类正常组织中分布情况及作用；利用Oncomine数据库分析候选上游转录因子在非小细胞肺癌中的作用。 　　实验结果： 　　1miR-96在非小细胞肺癌中的表达 　　1.1基因芯片分析miR-96在非小细胞肺癌组织和肺癌患者血浆中的表达水平 　　我们分别统计分析了3个肺癌组织数据包和1个肺癌血浆标本数据包的microRNA基因芯片原始实验数据。结果发现，在3个组织标本中，GSE51855组，与正常肺组织比较，miR-96在126例非小细胞肺癌组织中显著高表达(P＜0.001)；在GSE48414中，与正常肺组织比较，miR-96在154例肺腺癌组织中显著高表达(P＜0.001)；在GSE68305中，与配对的癌旁组织比较，miR-96在32例I期肺腺癌中显著高表达(P＜0.001)。实验结果提示，miR-96在非小细胞肺癌组织中高表达，可作为非小细胞肺癌临床诊断的辅助指标。GSE68951(血浆标本)分析发现，与其他非癌症肺部疾病患者比较，miR-96在肺癌患者血浆中的表达水平明显升高(P＜0.05)，提示miR-96可能成为一种循环肺癌分子标志物。我们还利用GSE48414的数据分析miR-96表达水平与患者的年龄、性别、临床分期之间的相关性，利用GSE51855的数据分析miR-96表达水平与非小细胞肺癌组织学分型的相关性。结果发现，miR-96的表达水平与患者的年龄、性别、临床分期及组织学分型之间没有明显的相关性(分别P=0.631、P=0.678、P=0.841及P=0.051)。 　　1.2miR-96在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达情况 　　qRT-PCR检测9对配对非小细胞肺癌和癌旁组织以及6株非小细胞肺癌细胞株，结果显示，与配对的癌旁组织比较，miR-96在非小细胞肺癌组织中的表达水平显著上调(均P＜0.001)；与永生化的人支气管上皮细胞16HBE比较，miR-96在H460、H1299、A549、95D、H520、PAa这6株非小细胞肺癌细胞株中高表达，且均P＜0.001。其中，miR-96在肺鳞状细胞癌细胞H520中的表达水平最高，其次是肺腺癌细胞H1299和PAa。 　　2miR-96的生物信息学分析 　　2.1miR-96靶基因预测结果 　　利用miRecords数据库对miR-96的靶基因进行预测，结果发现：至少6个靶标预测软件同时预测到的候选靶基因有71个，已有实验数据支持的靶基因有10个。5个软件共同预测到DAL-1是miR-96的候选靶基因。预测结果同时显示，DAL-1相关作用分子——CADM1也是miR-96的候选靶基因。 　　2.2miR-96靶基因生物信息学分析 　　针对miR-96靶基因进行GO分类和KEGG信号通路富集分析，按-ln(FDR)值从小到大将富集结果分类。结果显示：miR-96靶基因的GO分类主要富集于Wnt受体信号通路、对胰岛素刺激的反应及酪氨酸激酶信号通路、细胞通讯、细胞骨架以及钙信号转导通路紧密相关(P＜0.05)。KEGG信号通路富集分析结果显示：miR-96靶基因主要富集于促性腺激素释放激素信号通路和胰岛素信号通路，还有细胞间隙连接信号通路和前列腺癌信号通路(P＜0.05)。 　　3miR-96对非小细胞肺癌细胞体外生物学行为的影响 　　3.1miR-96过表达非小细胞肺癌细胞成功构建 　　结果显示，分别与H460、H460-NC细胞组比较，H460-miR-96细胞组miR-96的表达水平显著升高(均P＜0.01)；分别与A549、A549-NC细胞组比较，A549-miR-96细胞组中miR-96的表达水平亦显著升高(均P＜0.01)，说明已成功构建过表达miR-96的H460和A549细胞。 　　3.2稳定抑制miR-96表达的非小细胞肺癌细胞成功构建 　　结果显示，分别与A549、A549-NC细胞组比较，A549-miR-96inhibitor细胞组中miR-96的表达水平明显降低(均P＜0.05)；分别与H520、H520-NC细胞组比较，H520-miR-96inhibitor细胞组中miR-96的表达水平亦显著降低(均P＜0.01)，说明已成功构建稳定抑制miR-96表达的A549和H520细胞。 　　3.3miR-96过表达对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 　　平板克隆形成实验、细胞计数法、划痕实验和Transwell小室实验结果显示，分别与H460、H460-NC细胞比较，H460-miR-96细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力均显著增强(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01)；回复细胞中抑制miR-96的表达水平后，分别与H460-miR-96细胞比较，H460-miR-96+miR-96inhibitor细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力则显著下降(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01)；分别与A549、A549-NC细胞比较，A549-miR-96细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力均显著增强(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01)；回复细胞中抑制miR-96表达水平后，分别与A549-miR-96细胞比较，A549-miR-96+miR-96inhibitor细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力则显著下降(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05)。实验结果说明，miR-96过表达可促进非小细胞肺癌细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭 　　3.4miR-96稳定抑制对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 　　平板克隆形成实验、细胞计数法、划痕实验和Transwell小室实验检测miR-96结果显示：与A549、A549-NC细胞比较，A549-miR-96inhibitor细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力显著下降(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)；回复细胞中过表达miR-96后，与A549-miR-96inhibitor细胞比较，A549-miR-96inhibitor+miR-96细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力则显著增强(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)；与H520细胞和H520-NC细胞比较，H520-miR-96inhibitor细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力显著下降(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)；回复细胞中过表达miR-96后，与H520-miR-96inhibitor细胞比较，H520-miR-96inhibitor+miR-96细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力均显著增强(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。实验结果说明，稳定抑制miR-96表达可抑制非小细胞肺癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭。 　　4miR-96靶基因DAL-1和CADM1的鉴定 　　4.1DAL-1和CADM1蛋白在6株非小细胞肺癌细胞株和6对配对的非小细胞肺癌及配对癌旁组织中的表达情况 　　Westernblot结果显示：与永生化的人支气管上皮细胞16HBE比较，DAL-1和CADM1蛋白在A549、H460、H1299、95D、H520、pAa这6株非小细胞肺癌细胞株中的表达水平显著下调(均P＜0.01)；与配对的癌旁组织比较，DAL-1、CADM1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达水平均显著下调(均P＜0.01)。结果提示，DAL-1和CADM1在非小细胞肺癌中低表达，二者与miR-96在非小细胞肺癌中的表达水平具有负相关的趋势。 　　4.2miR-96对DAL-1、CADM1的表达调控作用 　　4.2.1miR-96在293t细胞中负调控DAL-1、CADM1的表达水平 　　实验结果显示：293t细胞过表达miR-96后，分别与293t、293t-NC细胞比较，细胞中DAL-1、CADMmRNA及蛋白的表达水平均明显下调(均P＜0.05)，说明在293t细胞中过表达miR-96可以下调DAL-1、CADM1基因的表达水平。293t细胞抑制miR-96表达后，分别与293t、293t-NC细胞比较，细胞中DAL-1、CADM1mRNA及蛋白的表达水平明显上调(各P＜0.05)，说明在293t细胞中抑制miR-96表达可以上调DAL-1、CADM1基因的表达。 　　4.2.2miR-96在非小细胞肺癌细胞中负调控DAL-1、CADM1的表达水平 　　miR-96mimic瞬时转染H460细胞组，分别与H460、H460-NC细胞组比较，DAL-1、CADM1mRNA及蛋白表达水平均明显下调(均P＜0.05)，说明过表达miR-96可以下调非小细胞肺癌细胞中DAL-1、CADM1的表达。 　　miR-96inhibitor瞬时转染H520细胞组，分别与H520、H520-NC细胞组比较，DAL-1、CADM1mRNA及蛋白表达水平均明显上调(均P＜0.05)，说明抑制miR-96表达可以上调非小细胞肺癌细胞中DAL-1、CADM1的表达。 　　稳定过表达miR-96的A549细胞组，分别与A549、A549-NC细胞组比较，A549-miR-96细胞中DAL-1、CADM1mRNA及蛋白表达水平均明显下调(均P＜0.05)；稳定过表达miR-96的H460细胞组，分别与H460、H460-NC细胞组比较，H460-miR-96细胞中DAL-1、CADM1mRNA及蛋白表达水平亦明显下调(均P＜0.05)，说明稳定过表达miR-96可以抑制非小细胞肺癌细胞中DAL-1、CADM1的表达。 　　稳定抑制miR-96表达的A549细胞组，分别与A549、A549-NC细胞组比较，A549-miR-96inhibitor细胞中DAL-1、CADM1mRNA和蛋白表达水平明显上调(均P＜0.05)；稳定抑制miR-96表达的H520细胞组，分别与H520、H520-NC细胞组比较，H520-miR-96inhibitor细胞中DAL-1、CADM1mRNA及蛋白表达水平明显上调(均P＜0.05)，说明稳定抑制miR-96表达可以上调非小细胞肺癌中DAL-1、CADM1的表达水平。 　　4.2.3双荧光素酶报告基因系统检测miR-96与DAL-1、CADM1的相互作用成功构建融合CADM1基因野生型和突变型3’UTR的psiCHECK-2-CADM13’UTR与psiCHECK-2-Mut-CADM13’UTR载体。 　　miR-96与DAL-1：与对照组比较，实验组的荧光素酶活性均显著降低(P＜0.01)，说明miR-96可与DAL-1基因3’UTR可以直接结合。 　　miR-96与CADM1：与对照组比较，实验组的荧光素酶活性均明显降低(P＜0.05)，说明miR-96可与CADM1基因3’UTR可以直接结合。 　　4.3CADM1与DAL-1在非小细胞肺癌细胞中竞争结合miR-96 　　采用阳离子脂质体法将CADM1siRNA转染至H460细胞，结果显示：与H460细胞组比较，H460-si-CADM1细胞组的CADM1mRNA及蛋白表达水平明显下调(均P＜0.05)，miR-96表达水平没有明显变化，DAL-1mRNA及蛋白表达水平下调(均P＜0.05)，说明靶基因CADM1和DAL-1可竞争性与miR-96结合。 　　4.4过表达DAL-1与抑制miR-96表达对非小细胞肺癌细胞生物学行为影响的比较 　　结果显示，与A549细胞组比较，A549-DAL-1细胞组的DAL-1mRNA及蛋白表达水平上调，而CADM1mRNA及蛋白表达水平无明显变化，A549-miR-96inhibitor细胞组的DAL-1、CADM1mRNA及蛋白表达水平同步上调。平板克隆形成实验、细胞计数法、划痕实验和Transwell小室实验结果显示：A549-miR-96细胞和A549-DAL-1细胞的迁移和侵袭能力没有明显差异(均P＞0.05)，但是，A549-miR-96inhibitor细胞的克隆形成和增殖能力明显弱于A549-DAL-1细胞(均P＜0.05)。结果说明，较之单独过表达DAL-1，抑制表达miR-96同时上调DAL-1、CADM1靶基因表达对非小细胞肺癌细胞克隆形成和增殖的抑制作用具有叠加效应。 　　5miR-96上游转录因子预测分析 　　5.1miR-96启动子序列 　　经Ensembl和UCSC数据库检索分析发现，miR-96前体(mir-96)基因上游400-1600bp这段序列是转录因子密集结合的区域，因此，选取mir-96上游2000bp作为miR-96的启动子序列。 　　5.2miR-96启动子的转录启动活性 　　成功构建融合miR-96启动子序列的miR-96promoter-PGL4.0重组载体。双荧光素酶报告基因检测系统检测结果显示：与空载组比较，转染miR-96promoter-PGL4.0重组载体后，239t细胞中的荧光素酶活性明显增强(P＜0.01)，说明，miR-96的启动子序列具有转录启动活性。 　　5.3miR-96上游转录因子预测 　　利用Footer和consit两个在线软件预测分析与miR-96启动子序列结合的候选上游转录因子。结果发现，这两个数据库共同预测到的候选转录因子有且只有1个——AML-1。 　　5.4生物信息学分析AML-1基因的作用 　　THEHUMANPROTEINATALS数据库检索结果显示，AML-1在人体多个组织器官中均有表达，正常肺组织中AML-1mRNA的表达水平为23.7TPM，该数据库的免疫组化半定量分析结果显示AML-1蛋白中度表达。oncomine数据库分析结果显示：与正常肺组织相比较，AML-1在肺腺癌中高表达(P＜0.05)。 　　结论: 　　1.miR-96在非小细胞肺癌患者组织、血浆及细胞株中高表达，是潜在的非小细胞肺癌辅助临床诊断指标及循环肿瘤标志物； 　　2.在非小细胞肺癌中，过表达miR-96可促进肿瘤细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭；抑制miR-96表达可抑制肿瘤细胞的克隆形成、增殖、迁移和侵袭，证明miR-96在非小细胞肺癌中发挥癌基因的作用。 　　3.DAL-1和CADM1是miR-96的靶基因，DAL-1与CADM1可以竞争结合miR-96。 　　4.miR-96可负向调控DAL-1、CADM1表达。在非小细胞肺癌细胞中抑制miR-96与单独过表达DAL-1相比，对肺癌细胞生长和增殖能力的抑制作用更加明显，说明通过调节miR-96的表达可以发挥对2个靶基因调节的叠加效应。5.生物信息学预测分析，AML-1是miR-96的候选上游转录因子，AML-1在非小细胞肺癌中高表达，AML-1可能通过上调miR-96的转录水平，并经miR-96/DAL-1/CADM1途径参与调节非小细胞肺癌的发生发展。