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利用CRISPR/Cas9技术构建KMT2D基因SET结构域敲除的人胚胎干细胞系

摘要目的:歌舞伎综合征(Kabuki Syndrome,KS)是一种罕见的遗传性疾病,其特征在于独特的面部外观、心脏异常、骨骼异常,免疫缺陷和轻度至中度精神发育迟滞。研究表明,55%-80%的KS病例是由KMT2D基因突变引起的,因此研究KMT2D突变导致KS发病机制具有重要意义。KMT2D是H3K4甲基转移酶,存在于身体许多器官和组织中。该蛋白C端含有一个SET结构域,该结构域具有甲基转移酶活性并维持细胞中本蛋白质的稳定性。为进一步研究KMT2D介导的H3K4甲基化在神经发育中的调控作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KMT2DSET结构域双等位基因敲除的人胚胎干细胞细胞系,为后期研究疾病机理提供可靠的细胞模型。<br>  方法:首先进行靶点分析设计sgRNA,针对SET结构域两侧各设计多条sgRNA,利用T7EI检测其切割效率,选取效率最高的sgRNA,构建到pX330载体中。同时,在切割位点两侧各选取1kb左右的序列作为同源臂,PCR特异性扩增同源臂,将左右同源臂同源重组到分别含有Puro或Hygro抗性基因的Donor上。将两个打靶载体与两个Donor共同电转至人胚胎干细胞系HN4中,通过Puro和Hygro双抗性筛选后,挑取单克隆,扩大培养,建立稳定的细胞系。利用PCR,测序以及q-PCR鉴定方法来分别检测HN4KMT2DSET结构域DNA以及mRNA水平的表达情况,最后对细胞系进行核型鉴定确认其核型是否正确。<br>  结果:成功构建了靶向KMT2DSET结构域两端的sgRNA的表达质粒,并对sgRNA进行T7EI切割效率的检测,选择最优sgRNA。改造原有载体,构建了具有KMT2D同源臂且含有Puro和Hygro不同抗性的Donor。PCR插入鉴定和单双敲鉴定结果显示,有8/12株细胞可同时扩增出Puro和Hygro两个目的片段,且无野生型条带。通过测序和序列比对确认样品确实发生了目的片段的同源重组,实现了双等位基因的敲除。q-PCR结果显示,mRNA层面上,SET结构域的碱基序列不表达,而其他位点则不受影响。核型检测证明KMT2DSET-/-细胞系核型正常。<br>  结论:成功构建pX330-sgRNA质粒,并验证其具有活性。成功构建了靶向KMT2DSET结构域的含有Puro和Hygro不同抗性的Donor。建立稳定的KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系,并通过核型检测证明其核型正确。为研究KMT2D基因的生理功能提供了理想的实验材料,也为研究由KMT2D突变引发KS的表观遗传机制奠定了基础,同时也在双等位基因敲除方法上提供了可借鉴的技术路线。

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导师 陈捷凯
学位信息:
广州医科大学 生物学 生物化学与分子生物学(硕士) 2020年
分类号 R596
发布时间 2021-01-20
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