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摘要目的：歌舞伎综合征(Kabuki Syndrome，KS)是一种罕见的遗传性疾病，其特征在于独特的面部外观、心脏异常、骨骼异常，免疫缺陷和轻度至中度精神发育迟滞。研究表明，55%-80%的KS病例是由KMT2D基因突变引起的，因此研究KMT2D突变导致KS发病机制具有重要意义。KMT2D是H3K4甲基转移酶，存在于身体许多器官和组织中。该蛋白C端含有一个SET结构域，该结构域具有甲基转移酶活性并维持细胞中本蛋白质的稳定性。为进一步研究KMT2D介导的H3K4甲基化在神经发育中的调控作用，本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KMT2DSET结构域双等位基因敲除的人胚胎干细胞细胞系，为后期研究疾病机理提供可靠的细胞模型。<br>　　方法：首先进行靶点分析设计sgRNA，针对SET结构域两侧各设计多条sgRNA，利用T7EI检测其切割效率，选取效率最高的sgRNA，构建到pX330载体中。同时，在切割位点两侧各选取1kb左右的序列作为同源臂，PCR特异性扩增同源臂，将左右同源臂同源重组到分别含有Puro或Hygro抗性基因的Donor上。将两个打靶载体与两个Donor共同电转至人胚胎干细胞系HN4中，通过Puro和Hygro双抗性筛选后，挑取单克隆，扩大培养，建立稳定的细胞系。利用PCR，测序以及q-PCR鉴定方法来分别检测HN4KMT2DSET结构域DNA以及mRNA水平的表达情况，最后对细胞系进行核型鉴定确认其核型是否正确。<br>　　结果：成功构建了靶向KMT2DSET结构域两端的sgRNA的表达质粒，并对sgRNA进行T7EI切割效率的检测，选择最优sgRNA。改造原有载体，构建了具有KMT2D同源臂且含有Puro和Hygro不同抗性的Donor。PCR插入鉴定和单双敲鉴定结果显示，有8/12株细胞可同时扩增出Puro和Hygro两个目的片段，且无野生型条带。通过测序和序列比对确认样品确实发生了目的片段的同源重组，实现了双等位基因的敲除。q-PCR结果显示，mRNA层面上，SET结构域的碱基序列不表达，而其他位点则不受影响。核型检测证明KMT2DSET-/-细胞系核型正常。<br>　　结论：成功构建pX330-sgRNA质粒，并验证其具有活性。成功构建了靶向KMT2DSET结构域的含有Puro和Hygro不同抗性的Donor。建立稳定的KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系，并通过核型检测证明其核型正确。为研究KMT2D基因的生理功能提供了理想的实验材料，也为研究由KMT2D突变引发KS的表观遗传机制奠定了基础，同时也在双等位基因敲除方法上提供了可借鉴的技术路线。