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摘要目的<br>　　视网膜新生血管(Retina neovascularization, RNV)是视网膜或视盘表面新生成的沿视网膜表面生长或突破视网膜进入玻璃体腔的血管，它是导致多个年龄段人群不可逆失明的重要原因。本研究旨在通过构建经典的、均一稳定的RNV模型——氧诱导视网膜病变(Oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型、应用蛋白芯片分析发现RNV发生、发展过程中的重要细胞因子——血小板因子4(Platelet factor 4, PF4)，进一步探索PF4对RNV的形成和对视网膜血管内皮细胞的增殖、移行和管腔形成功能的作用及其下游分子机制，为进一步了解RNV的发生、发展机制提供可靠信息，也为治疗RNV相关疾病提供新的思路和线索。<br>　　方法<br>　　1、OIR小鼠模型的构建：将出生后第7天(Postnatal day 7, P7)的C57BL/6J小鼠暴露于氧气浓度为75%的环境中5天，至P12，随后将小鼠置于正常空气环境中继续饲养5天，至P17，从而构建OIR小鼠模型。OIR小鼠模型的鉴定：应用视网膜铺片植物凝集素(Isolectin B4, IB4)染色、视网膜组织石蜡切片HE染色检测视网膜无血管区和新生血管的形成情况，从而确认OIR小鼠模型是否构建成功。然后通过蛋白芯片分析技术对比分析OIR小鼠视网膜和正常小鼠视网膜蛋白的表达差异，从而发现在RNV发生、发展过程中发挥重要作用的细胞因子——PF4，进一步通过蛋白印记(Western blot, WB)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)验证蛋白芯片分析的结果。<br>　　2、按照上述方法构建OIR小鼠模型并在P12通过向OIR小鼠玻璃体腔内注射PF4给予局部干预，应用视网膜铺片IB4染色检测视网膜无血管区和新生血管的形成情况，从而确认OIR小鼠模型的构建情况和PF4在体内对RNV的作用。在体外研究中，培养猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)并通过给予血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)和肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactorα,TNF-α)模拟促视网膜血管生成和炎症微环境，进一步通过给予PF4干预并检测RF/6A细胞的增殖、移行和管腔形成能力确认PF4在体外对RF/6A细胞功能的影响。<br>　　3、通过磷酸化蛋白芯片分析技术对比分析正常小鼠视网膜、OIR小鼠视网膜和给予PF4注射干预的OIR小鼠视网膜中蛋白的表达水平差异发现PF4作用于RNV的靶点——富含脯氨酸的Akt底物40(Proline-rich Akt substrate 40 kDa, PRAS40)。构建含有PRAS40基因的慢病毒和含有磷酸化位点缺陷的PRAS40基因的慢病毒，并通过向OIR小鼠玻璃体腔内注射这两种慢病毒之一来实现OIR小鼠眼内PRAS40基因的过表达并进一步研究PRAS40磷酸化的作用。同理，应用视网膜铺片IB4染色检测视网膜无血管区和新生血管的形成情况确认OIR小鼠的构建情况、体内PF4对RNV的作用效果、过表达PRAS40和过表达磷酸化位点突变PRAS40对PF4对RNV作用效果的影响。在体外实验中，我们构建表达PRAS40的质粒并转染至RF/6A细胞内，通过检测RF/6A细胞增殖、移行和管腔形成能力确认VEGF和TNF-α对RF/6A细胞功能的促进情况、PF4对RF/6A细胞功能的影响和PRAS40对PF4对RF/6A细胞作用效果的影响。进而明确PF4抑制RNV和视网膜血管内皮细胞相关功能的机制。<br>　　结果<br>　　1、按照上述方法构建OIR小鼠模型后，视网膜铺片IB4染色显示OIR小鼠视网膜的无血管区和新生血管均较正常小鼠视网膜明显增多；视网膜石蜡切片HE染色显示OIR小鼠的视网膜前细胞核数目较正常小鼠视网膜前细胞核数目显著增多；这两项结果表示OIR小鼠模型构建成功。蛋白芯片分析显示OIR小鼠视网膜较正常小鼠视网膜中PF4蛋白表达水平增加是所有蛋白表达水平变化最显著的细胞因子；ELISA检测结果进一步确认了OIR小鼠视网膜中PF4较正常小鼠视网膜显著增加。<br>　　2、体内实验中视网膜铺片IB4染色显示OIR组小鼠视网膜无血管区和新生血管均明显多于正常组小鼠视网膜，表明OIR小鼠模型构建成功；而PF4注射组的小鼠视网膜中无血管区和新生血管相对面积均明显较未注射的OIR组小鼠视网膜显著减少。体外细胞实验中VEGF和TNF-α刺激组的RF/6A细胞增殖、移行和管腔形成能力均较正常组RF/6A细胞明显增加；而给予PF4干预的RF/6A细胞增殖、移行和管腔形成能力均较仅给予VEGF和TNF-α刺激的RF/6A细胞明显降低。<br>　　3、磷酸化蛋白芯片分析结果显示PF4注射组小鼠视网膜中PRAS40蛋白的磷酸化水平较未注射的OIR组小鼠视网膜显著减少。体内实验中视网膜铺片IB4染色显示PF4注射组小鼠视网膜无血管区和新生血管相对面积均较未给予PF4玻璃体腔注射的OIR组小鼠视网膜显著减少；给予PRAS40慢病毒和PF4注射组的小鼠视网膜无血管区和新生血管相对面积均较仅给予PF4注射组的小鼠视网膜显著增多；而给予磷酸化位点突变PRAS40慢病毒和PF4注射组的小鼠视网膜无血管区和新生血管相对面积均较仅给予PF4注射组的小鼠视网膜无明显差异；体外细胞实验中给予PF4干预的RF/6A细胞增殖、移行和管腔形成能力均明显较仅给予VEGF和TNF-α刺激而未给予PF4的RF/6A细胞明显降低；而经PRAS40质粒转染和PF4干预的RF/6A细胞增殖、移行和管腔形成能力均明显较仅给予PF4干预的RF/6A细胞增加。<br>　　结论<br>　　PF4可以在体内有效地抑制OIR小鼠视网膜无血管区和新生血管形成、在体外有效抑制RF/6A细胞的增殖、移行和管腔形成。PF4这一作用效果是通过下调PRAS40的磷酸化水平实现的。