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摘要研究背景和目的<br>　　自20世纪以来，癌症已经成为威胁人类健康的主要疾病。国际癌症研究机构于2012年评估了世界范围内的27个主要癌症的发病率和死亡率，结果显示有1410万癌症新发病例和820万癌症相关死亡病例，这其中约有22%的新增癌症病例和27%的癌症死亡病例发生在中国。众所周知，恶性肿瘤的不良预后往往与其早期发生转移密切相关。转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征之一，也是临床上大多数肿瘤患者致死的最主要因素，约90%的癌症患者死于肿瘤的转移。可以说，转移是肿瘤临床治疗过程中面临的最为严峻的考验，也是目前肿瘤研究的热点之一。细胞间粘附能力的改变在肿瘤转移的过程中发挥重要作用，而细胞粘附分子(Cell adhesion molecules, CAMs)与肿瘤细胞粘附能力的改变密切相关，但其机制仍亟待阐明。<br>　　本课题前期通过对不同复发转移特征的两组巴塞罗那分期(BCLC staging)为B期的肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)患者的肿瘤组织进行全转录组测序后发现，两组患者的差异表达基因显著富集在粘附相关通路，进一步通过Heatmap分析，对富集在粘附通路中的差异表达基因进行提取和比对后发现，SVEP1作为一种CAMs分子在术后高复发组HCC中的表达显著低于低复发组，结合国内外相关报道及前期研究结果，推测SVEP1可能是参与介导肝癌复发转移的关键分子。因此，本课题拟通过免疫组化、生物信息学分析、免疫印迹、RT-PCR、体外细胞功能实验、双荧光素酶报告实验、全转录组测序分析、恢复实验和体内动物实验等研究手段明确SVEP1与HCC复发转移间的关系以及探究SVEP1参与调控HCC转移的分子机制。<br>　　研究方法<br>　　1.应用207例肝癌组织芯片和4对肝癌冰冻组织样本，借助免疫组化、单因素Kplan-Meier法、多因素Cox法、Spearman相关性分析、亚组分析和免疫印迹实验初步探究SVEP1在肝癌中的表达情况及其对肝癌患者预后的影响。<br>　　2.基于TCGA及GEO数据库，使用生物信息学分析(差异表达分析、生存分析和GSEA分析)进一步验证免疫组化及免疫印迹实验得到的结论。<br>　　3.使用免疫印迹法检测不同肝癌细胞株中SVEP1的表达水平差异，应用慢病毒感染法构建SVEP1稳定降表达组和相应对照组的肝癌细胞系。<br>　　4.应用SVEP1稳定降表达的肝癌细胞系及其对照细胞系，进行细胞增殖相关实验(CCK-8实验)和细胞侵袭迁移相关实验(趋化实验、侵袭实验、运动实验及划痕实验)，探究SVEP1的不同表达水平对肝癌细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。<br>　　5.重新比对不同复发风险的BCLC-B期肝癌患者的转录组测序结果并结合miRWalk、RNA22、miRanda、Targetscan、mirbase等五种公共数据库，寻找可以潜在调控SVEP1的microRNA。<br>　　6.应用TCGA公共数据库对相关microRNA进行差异表达分析及生存分析验证。<br>　　7.应用双荧光素酶报告实验进一步验证相关microRNA对SVEP1的直接调控作用，在肝癌细胞系中转染miRNAmimics/inhibitors以及相应对照并验证，同时检测其中SVEP1的表达水平，应用功能实验验证microRNA的不同表达水平对肝癌细胞功能的影响。<br>　　8.将前期成功构建的SVEP1降表达肝癌细胞系及对照组细胞系进行全转录组测序分析，寻找差异基因及相关富集通路，应用免疫印迹、细胞功能实验和恢复实验进一步探索SVEP1调控肝癌进展的下游分子网络。<br>　　9.构建SVEP1降表达及对照组细胞系的小鼠肝癌移植瘤模型，在体内观察SVEP1的不同表达水平对肝癌细胞增殖和侵袭转移的影响，同时验证相关信号通路中重要分子表达水平的改变。<br>　　研究结果<br>　　1.通过不同复发风险的BCLC-B期肝癌患者的全转录组测序分析发现，差异基因显著富集在粘附通路，其中SVEP1在高复发风险肝癌患者中显著低表达；TCGA、GEO及GSEA分析证实SVEP1在HCC组织中低表达，且低表达与不良预后相关。<br>　　2.通过免疫印迹及免疫组化实验发现，SVEP1在HCC癌旁组织中的表达水平显著高于其相应癌组织中的表达水平，并且低表达SVEP1是影响HCC总生存期(overall survival, OS)和无复发生存期(disease-free survival, DFS)的独立危险因素；通过Spearman法分析了SVEP1的表达水平与临床病理学因素间的相关性，发现SVEP1的表达水平与肝癌的肿瘤大小(定义3cm为肿瘤大小的临界值)和微卫星病灶的发生率显著负相关；此外，在肿瘤直径≥3cm和伴有微卫星结节的肝癌高危亚组患者中，SVEP1的高表达是影响肝癌预后的重要保护因素。<br>　　3.SVEP1在肝癌细胞系Hep3B和MHCCLM3中表达水平较高，构建并验证SVEP1-SCR/KD的肝癌细胞系。<br>　　4.CCK-8实验证实降表达SVEP1的肝癌细胞系增殖能力较对照组更强；划痕实验、趋化实验、侵袭实验及高内涵显微镜运动实验证实降表达SVEP1的肝癌细胞系侵袭迁移能力较对照组更强。<br>　　5.基于全转录组测序数据及Targetscan等公共数据库，发现miR-1269b可以潜在调控SVEP1的转录水平。<br>　　6.TCGA数据库分析表明miR-1269b在肝癌中的表达水平显著高于其相应的癌旁组织，高表达miR-1269b的肝癌患者预后不佳。<br>　　7.双荧光素酶报告实验证实miR-1269b可以直接调控SVEP1的转录水平，利用RT-PCR、免疫印迹及划痕实验证实，抑制miR-1269b表达可促进SVEP1表达水平的升高，进而介导了肝癌细胞运动能力减弱；而促进miR-1269b表达则可抑制SVEP1的表达，从而介导了肝癌细胞运动能力的增强。<br>　　8.通过对Hep3B-SCR及KD细胞系的全转录组测序分析发现，差异表达基因主要富集在PI3K/Akt信号通路中，Heatmap分析结果证实降表达SVEP1可以介导PI3K/Akt信号通路中FGF9、THBS1、NFKB1、CCNE2等重要基因表达水平的上调，应用RT-PCR实验在Hep3B-SCR/KD细胞系中二次验证以上结论。<br>　　9.Hep3B-SCR/KD以及Hep3B-KD+LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)细胞株中p-Akt308的表达水平发生了改变，而总AKT和p-Akt473的表达水平不变；与Hep3B-KD细胞系相比，Hep3B-KD+LY294002细胞的增殖和侵袭能力下降。<br>　　10.动物实验结果表明，与对照组细胞形成的移植瘤模型相比，SVEP1-KD组移植瘤模型的瘤体积更大且容易发生肺转移，同时p-Akt308和PKCζ的表达水平更高。<br>　　研究结论<br>　　SVEP1作为细胞与细胞间粘附的重要CAMs分子，在调控细胞及组织稳态的过程中发挥着重要的作用。目前，尚没有任何数据阐释SVEP1在恶性肿瘤进展及转移过程中的具体调控机制。本课题前期经过对不同复发转移风险的两组BCLC分期为B期的肝癌患者组织样本进行全转录组测序分析，筛选出了富集在粘附通路中的差异表达基因SVEP1，进一步通过大样本免疫组化染色分析结合TCGA/GEO数据库分析，初步明确了SVEP1低表达可作为预测肝癌预后的独立危险因素，低表达SVEP1与肿瘤的大小和转移密切相关；通过一系列细胞功能实验证实降表达SVEP1可以促进肝癌细胞的增殖和侵袭转移；通过全转录组测序、公共数据库分析发现miR-1269b可以调控SVEP1的转录水平，进一步的分子生物学实验证实SVEP1是miR-1269b的直接靶基因。SVEP1通过PI3K/Akt信号通路调控肝癌的恶性表型转化，通过移植瘤模型证实低表达SVEP1促进肝癌的进展。本课题结合生物样本大数据库分析、分子生物学实验、细胞生物学实验及移植瘤模型等多种方法证实了SVEP1在肝癌恶性表型转化过程中的作用及分子机制，阐明了miR-1269b-SVEP1-PI3K/Akt生物学轴在肝癌增殖和侵袭转移中的作用，对丰富临床治疗手段或治疗靶点有着至关重要的作用。