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摘要研究目的：<br>　　含有TUDOR结构域的蛋白质(TDRD)主要负责识别甲基化的赖氨酸、精氨酸残基。“Reader”识别器蛋白对甲基化修饰的赖氨酸、精氨酸组蛋白的识别构成了复杂的基因表达调控网络，涉及多种生物过程，如多能性，分化和肿瘤发生。然而，人们对TDRDs调节异常对乳腺癌发展的认识知之甚少。PHF20L1和PHF20是经典的TDRD，它们拥有相似的结构域。据报道，PHF20识别组蛋白、非组蛋白的甲基化并涉及到细胞重编程过程，同时PHF20L1能够识别非组蛋白甲基化。然而，它在乳腺癌中识别组蛋白的作用并没有报道。几个研究小组已经证明PRC2和NuRD复合物可协同介导H3K27残基上甲基化和乙酰化的稳态，以调节胚胎干(ES)细胞中静默基因的表达。然而，PRC2和NuRD对H3K27位点的修饰的调节仍有待在癌症中进一步探索。因此，本研究旨在探讨以下三个问题。<br>　　1.PHF20L1失调如何促进乳腺癌的发展;<br>　　2.PHF20L1在乳腺癌中能否识别亦或如何识别组蛋白修饰;<br>　　3.在乳腺癌中PRC2和NuRD复合物对H3K27位点修饰的调节。<br>　　研究方法：<br>　　1.通过在MDA-MB-231细胞中转染针对指定TDRDs的siRNA，然后进行细胞生长曲线和EdU实验，以鉴定新的乳腺癌增殖调控因子。<br>　　2.用组蛋白修饰肽阵来筛选PHF20L1的潜在结合位点，然后用组蛋白多肽pull-down实验验证筛选结果的，ITC滴定曲线和SPR实验分析以进一步验证PHF20L1TUDOR结构域对H3K27me2的识别作用。<br>　　3.稳定表达FLAG-PHF20L1的HEK293T细胞提取物使用抗FLAG珠子进行亲和纯化，并使用SDS-PAGE凝胶分离洗脱液，然后进行银染鉴定PHF20L1相互作用蛋白质。免疫沉共淀和GST/Hispull-down实验以阐明PHF20L1、NuRD和PRC2之间分子间相互作用机制。最后用Gal4驱动的荧光素酶报告系统粗略测定PHF20L1的转录活性。<br>　　4.在正常或敲低PHF20L1的MDA-MB-231细胞中用特异性的PHF20L1、EZH2、MTA1、H3K27me2、H3K27me3和H3K27ac抗体进行染色质免疫沉淀实验，和后续的深度测序(ChIP-Seq)实验。深度数据分析结果显示PHF20L1与H3K27me2在整个基因组中有着明显的共定位现象，且这是PRC2和NuRD在PHF20L1占位基因区域富集所必需的。在正常和敲低PHF20L1的MDA-MB-231细胞中进行一系列的qChIP实验对ChIP-Seq的结果进行了进一步的佐证。<br>　　5.敲低PHF20L1并进行转录组RNA测序分析(RNA-Seq)来探究PHF20L1的转录靶标；通过进一步的基因集富集分析(GSEA)得到MYC信号通路和缺氧信号通路的基因集富集，然后进行qChIP实验以检测PHF20L1启动子上的MYC和HIF1?结合情况。接下来使用SeahorseXFe24系统(Seahorse Bioscience)测量由PHF20L1缺失或其他指定处理引起的糖酵解水平的变化情况。<br>　　6.在缺失PHF20L1的MDA-MB-231细胞中进行碘化丙啶染色流式细胞仪细胞周期分析，克隆形成实验，以及transwell侵袭实验，来探索PHF20L1对乳腺癌细胞的细胞周期，增殖和转移的影响。在稳定转染对照、shPHF20L1，EZH2、MTA1、shPHF20L1+EZH2以及shPHF20L1+MTA1的MDA-MB-231细胞中进行克隆形成实验和transwell实验以评估PHF20L1，MTA1和EZH2对乳腺癌细胞增殖和转移的协同作用。通过小鼠模型MDA-MB-231细胞乳腺原位接种成瘤以及尾静脉注射MDA-MB-231细胞的肺转移实验，以评估PHF20L1，MTA1和EZH2在体内对乳腺癌增殖和转移的影响。<br>　　7.通过对收集的203份乳腺癌样本进行免疫组织化学染色分析PHF20L1，EZH2，MTA1和HIC1的表达谱，并进一步对两个公开的乳腺癌临床GEO数据库(GSE2034和GSE4922)的mRNA表达数据进行数据挖掘，以探究MYC/HIF1?-(PHF20L1-MTA1-EZH2)-FOXK2/HIC1轴在乳腺癌中的临床病理学相关性。使用网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)来预测PHF20L1在多个癌中的基因表达谱来综合分析PHF20L1在不同癌症中的表达情况。<br>　　8.使用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立Phf2011敲除小鼠，以探究PHF20L1在小鼠发育中的作用。通过携带floxed的Phf2011基因编辑小鼠与MMTV-Cre小鼠的配繁以产生Phf2011-/-乳腺条件性敲除(CKO)小鼠，其中Cre表达由小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTVcre)驱动，来研究Phf2011在乳腺发育中的功能。<br>　　实验结果：<br>　　1.基于RNAi筛选得到PHF20L1作为新的乳腺癌增殖调节因子。<br>　　2.PHF20L1的TUDOR结构域是一种新型的H3K27me2识别模序。<br>　　3.PHF20L1与PRC2和NuRD复合物一起协同发挥转录抑制作用。<br>　　4.PRC2和NuRD在PHF20L1靶基因区域的占位需要基因组中PHF20L1和H3K27me2的共定位。<br>　　5.作为MYC和HIF1?驱动的潜在致癌基因，PHF20L1与PRC2和NuRD复合物一起直接抑制一系列肿瘤抑制因子如FOXK2、HIC1等进而调节糖酵解过程。<br>　　6.PHF20L1与其相互作用的转录抑制复合物协同作用，促进乳腺癌的发生发展。<br>　　7.MYC/HIF1?-(PHF20L1-NuRD-MTA1)-FOXK2/HIC1轴在乳腺癌中具有密切的相关性，预示PHF20L1可作为乳腺癌的潜在治疗靶点。<br>　　8.Phf20l1缺失诱导小鼠生长迟缓和乳腺导管发育延迟。<br>　　实验结论：<br>　　在本论文中，我们描述了含有TUDOR结构域的蛋白质PHF20L1作为新型H3K27me2阅读器蛋白，能够通过将多梳抑制复合物2(PRC2)，Mi-2/核小体重塑和脱乙酰酶(NuRD)复合物募集到特定染色质区域来发挥转录抑制活性，进而将PRC2介导的H3K27位点甲基化修饰和NuRD介导的H3K27脱乙酰化联系到了一起。此外，我们发现PHF20L1作为MYC和HIF1?驱动的潜在致癌基因，通过直接抑制肿瘤抑制因子如FOXK2和HIC1促进乳腺癌细胞的增殖、转移和糖酵解过程。PHF20L1高表达也与较高的乳腺癌组织学分级密切相关，并且在部分人类癌症中显着上调。Phf20l1敲除小鼠表现出严重的生长迟缓表型，并且Phf20l1的条件性缺失导致不适当的乳腺发育。我们的研究表明，PHF20L1是癌症治疗的一个具有光明前景的靶点，探索PHF20L1在乳腺癌中的功能将有助于提供更具建设性和有效的治疗策略。