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摘要【目的】<br>　　探讨长链非编码RNA(lncRNA)HOTAIRM1在氢醌(hydroquinone, HQ)诱导TK6恶性转化细胞和苯暴露工人血液标本中异常表达的分子机制。<br>　　【方法】<br>　　1.细胞及苯暴露工人的选择<br>　　人类正常淋巴母TK6细胞是由四川大学张立实教授所赠送，HQ诱导TK6恶性转化细胞由课题组前期建立，并命名为HQ-MT细胞；以109例苯暴露工人为研究的苯暴露的研究对象，并根据暴露组的年龄、性别、吸烟和饮酒史，将非苯暴露组进行1:1配对。<br>　　2.药物的处理<br>　　使用DNMT甲基化转移酶抑制剂(5-aza-2’-deoxycytidine, 5-AzaC)、组蛋白去乙酰化抑制剂(trichostatin A, TSA)处理HQ-MT细胞，培养24h，收集细胞并进行相关检测。<br>　　3.基因表达水平的检测<br>　　细胞和血液总RNA分别时使用TRIzol试剂和PureLink?RNAMiniKit试剂盒进行提取，反转录生成cDNA后采用实时荧光定量PCR检测细胞lncRNA及相关mRNA的表达水平。收集细胞后使用裂解液，裂解细胞提取总蛋白，通过用BCA法检测蛋白浓度，Westernblotting的方法检测相关蛋白的表达水平。<br>　　4.甲基化特异性PCR(Methyl-spscific PCR, MSP)检测基因启动子区甲基化水平<br>　　在数据库中查找基因启动子区上游2000bp的DNA序列，并用MethPrimer软件对启动子区的CpG岛进行了分析并设计引物，使用PCR法将已经进行甲基化修饰的DNA样品检测其甲基化水平。<br>　　5.生物信息学的分析<br>　　在生物信息网站(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/)预测RNA与蛋白质的相互结合作用。<br>　　6.DNMT3b敲除细胞株的构建<br>　　采用CRISPR/CAS9基因编辑方法，在课题组前期建立的CAS9稳定转染HQ-MT细胞株，再转染空载体或靶向敲除DNMT3b的慢病毒，使用单克隆方法挑选出稳定的细胞株，用qRT-PCR和Westernblotting对DNMT3b表达量进行敲除鉴定。<br>　　7.统计分析<br>　　实验结果的各项指标通过使用SPSS软件进行统计学分析。计量资料采用表示，采用t检验进行组间比较，检验水准ɑ=0.05。<br>　　【结果】<br>　　1.LncRNAs在HQ-MT细胞中的表达情况<br>　　qRT-PCR检测结果显示，HOTAIRM1、LncRNAPLIN2、LncRNA-CRNDE和LINC-PINT的表达水平，与PBS对照组相比，HOTAIRM1的表达量在HQ-MT细胞中的表达水平下降，而LINC-PINT的表达升高。<br>　　2.5-AzaC和TSA处理HQ-MT细胞对lncRNAs和DNMT3b表达水平的影响<br>　　与PBS对照组相比，5-AzaC或TSA处理HQ-MT细胞，可以使HOTAIRM1的表达水平升高；5-AzaC处理HQ-MT细胞对lncRNACASC15的表达水平升高；而TSA处理HQ-MT细胞对LUNAR1的表达水平升高；DNMT3b在5-AzaC或TSA处理组中表达均下降。<br>　　3.HOTAIRM1和DNMTs在HQ早期处理细胞中的表达情况<br>　　与对照组相比，HQ处理细胞24h、48h、72h后HOTAIRM1的表达升高，但与48h相比，72h的表达明显下降；DNMT1、DNMT3b的表达下降，而DNMT3a的表达并无明显变化。<br>　　4.苯暴露人群血液中HOTAIRM1的表达与苯暴露时间有关<br>　　以非苯暴露工人为对照组，检测HOTAIRM1在苯暴露工人中的表达，在1.5年苯暴露时间内，HOTAIRM1的表达升高；而其余暴露时间较长，HOTAIRM1平均表达减少。相关分析HOTAIRM1在苯暴露工人中的表达与苯暴露时间的关系，结果发现随着苯暴露时间的增加，HOTAIRM1的表达下降。<br>　　5.DNMT3b调节HOTAIRM1的生物信息预测<br>　　经过分析HOTAIRM1的CpG岛，进行生信预测结果发现存在与DNMT3b结合的位点；进一步在生物信息网站上预测HOTAIRM和DNMT3b的相互作用，结果显示RF与SVM值均大于0.5，提示两者间存在相互调控的作用。<br>　　6.HOTAIRM1启动子区甲基化的情况<br>　　提取PBS组、HQ-MT细胞以及5-AzaC和TSA处理HQ-MT细胞的DNA进行MSP检测，结果表明，在HQ-MT细胞中HOTAIRM1的甲基化水平升高，经5-AzaC和TSA处理后其甲基化水平下降。在苯暴露工人中，其启动子区甲基化水平与HOTAIRM1的表达水平呈负相关。<br>　　7.DNMT3b介导的启动子高甲基化导致HOTAIRM1下调<br>　　与KO-DNMT3b-NC对照组细胞相比，在HQ-MT细胞敲除DNMT3b后，HOTAIRM1的表达升高，通过MSP方法检测启动子甲基化水平，甲基化程度下降。<br>　　【结论】<br>　　1.HOTAIRM1在TK6细胞和苯暴露工人中表达随HQ处理或苯暴露时间的延长先升高后降低。<br>　　2.在HQ-MT细胞中DNMT3b上调诱导的启动子区DNA高甲基化从而抑HOTAIRM1的表达。