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摘要【目的】<br>　　糖尿病(Diabetes mellitus)是心血管疾病的独立危险因素，作为糖尿病重要并发症之一，糖尿病心肌病严重危害着人类的生命健康。近年来关于糖尿病心肌病的研究不断深入，但其发病机制复杂，尚无明确的诊断依据及针对性的治疗措施。APE1(脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1)的两个主要功能是氧化还原与DNA修复，在癌症、免疫及心血管疾病等领域起到了不可忽视的作用。外泌体(Exosomes，EXs)是一种细胞间信息传递的囊泡结构，是细胞间信息交流和调控细胞功能的重要信使。本实验主要探究过表达APE1的内皮细胞外泌体是否对高糖环境下损伤的心肌细胞有修复作用，试图以过表达APE1的内皮细胞外泌体为手段寻找治疗糖尿病心肌病的新方法。<br>　　【方法】<br>　　1.构建过表达APE1的内皮细胞模型并提取外泌体：利用过表达APE1的重组Admax腺病毒(Ad-APE1)转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，筛选鉴定过表达APE1的细胞为HUVECAd-APE1用于制备HUVEC-EXsAd-APE1，并用YFP腺病毒载体(Ad-YFP)作为阴性对照转染HUVECs制备HUVEC-ExsAd-YFP，应用QRT-PCR及Westernblot技术检测APE1mRNA和APE1蛋白表达情况。<br>　　2.外泌体与心肌细胞共培养：利用33mM葡萄糖培养基处理AC16细胞获得AC16HG，并用5.5mM葡萄糖培养基处理AC16细胞作为对照组获得AC16CON。将AC16CON分为腺病毒阴性对照组(YFP组)、APE1过表达组(APE1组)，AC16HG分为高糖组(HG+YFP组)、高糖+APE1过表达组(HG+APE1组)，与转染后的内皮细胞外泌体共培养24h。<br>　　3.检测共培养后心肌细胞氧化应激相关指标：应用DCFH-DA染色检测ROS水平，相应试剂盒检测SOD、GSH-Px活性及MDA水平评价氧化应激改变。<br>　　4.评估共培养后心肌细胞活力、损伤、凋亡水平：CCK8实验检测心肌细胞活力，LDH检测试剂盒检测心肌细胞培养上清液中LDH水平，流式细胞学实验检测心肌细胞凋亡水平。<br>　　5.蛋白质免疫印迹法(Western blot )检测共培养后AC16心肌细胞中p38MAPK、P-Akt/Akt蛋白表达情况。<br>　　【结果】<br>　　1．过表达APE1的内皮细胞模型构建成功：QRT-PCR及Westernblot检测结果显示：与YFP组相比，过表达APE1的内皮细胞及其外泌体中APE1mRNA和APE1蛋白水平表达明显上调。<br>　　2．氧化应激相关指标检测结果显示：与YFP阴性对照组相比，HG+YFP组心肌细胞ROS、MDA水平明显升高，SOD、GSH-Px活性明显减弱；而与HG+YFP组相比，HG+APE1组心肌细胞ROS、MDA水平明显降低，SOD、GSH-Px活性明显增强。<br>　　3．CCK-8实验检测细胞活力显示：与YFP阴性对照组相比，HG+YFP组心肌细胞细胞活力降低；与HG+YFP组相比，HG+APE1组心肌细胞细胞活力增强。<br>　　4．LDH检测结果显示：与YFP阴性对照组相比，HG+YFP组心肌细胞培养上清液中LDH水平升高；与HG+YFP组相比，HG+APE1组心肌细胞培养上清液中LDH水平降低。<br>　　5．流式细胞学实验结果显示：与YFP阴性对照组相比，HG+YFP组心肌细胞凋亡增多，与HG+YFP组相比，HG+APE1组心肌细胞凋亡减少。<br>　　6．Westernblot检测结果显示：与YFP阴性对照组相比，HG+YFP组心肌细胞p38MAPK蛋白表达水平上调，而P-Akt蛋白表达水平明显下调；与HG+YFP组相比，HG+APE1组心肌细胞p38MAPK蛋白表达水平下调，而P-Akt蛋白表达水平上调。<br>　　【结论】<br>　　过表达APE1的内皮细胞外泌体可能通过抑制p38通路、激活Akt通路修复高糖环境下损伤的心肌。