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摘要桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)是一种世界性害虫，已经给农业生产造成了巨大的经济损失。化学防治是重要的防治措施，然而长期化学农药的应用，导致了桔小实蝇出现了不同程度的抗药性，因此，该虫的防控工作变得越来越艰巨，寻找新的有效的防控途径成为一项迫切的任务。在本论文中，我们比较了5个具有不同蛹色的桔小实蝇品系的抗药性，分析了这5个品系蛹的转录组，比较了这5个品系蛹和成虫的乙酰胆碱酯酶AChE、谷胱甘肽S-转移酶GST和细胞色素氧化酶P450酶活性，分析了9个候选基因在这5个品系成虫和蛹的表达量，研究了3个候选基因在经3种药剂处理的成虫和中肠的表达量和2个酶(AChE、GST)在经3种药剂处理的成虫和中肠的活性，证明了桔小实蝇蛹色和成虫抗药性之间存在联系，并最终找到3个与桔小实蝇蛹着色相关并且可以促进桔小实蝇抗药性的基因(多巴色素转化酶家族DEC的yellow基因MK529913、yellow基因MK529915和芳烷基胺乙酰转移酶AANAT基因MK515144)。这些研究结果可以为桔小实蝇的抗性机制研究和害虫防治提供新依据。详细结果如下：<br>　　1桔小实蝇5个品系成虫对高效氯氰菊酯、阿维菌素和敌百虫的抗性比较<br>　　本研究采用药膜法测试了桔小实蝇5个品系成虫对高效氯氰菊酯，阿维菌素和敌百虫的抗药性，5个品系对前两种药剂的抗性均为CZ＞CB＞CK＞LC≈LX(由大至小)，对敌百虫的抗性为CZ＞LC＞CK＞LX≈CB。其中，品系CZ是桔小实蝇高效氯氰菊酯中抗品系，蛹色为褐色；品系CB是蛹色白化突变品系，蛹色为白色；品系CK是野生敏感品系，蛹色为褐色；品系LC是遗传性别品系GSS的雌虫，蛹色为白色；品系LX是遗传性别品系GSS的雄虫，蛹色为褐色。此处研究结果证明5个品系不仅存在蛹色的差异，也存在成虫抗药性的差异。<br>　　2桔小实蝇5个品系蛹的转录组<br>　　基于桔小实蝇5个品系蛹的转录组，本研究对5个品系的基因表达关系、与着色相关基因的功能分布、与解毒相关基因的功能分布和品系间差异基因的功能分布进行分析，在5个品系蛹的转录组中找到了24个与着色相关的基因和165个与解毒酶相关的基因，证明了敏感品系CK与白化突变品系CB的基因表达模式相似(斯皮尔曼相关系数为0.85)，伴性品系LC和伴性品系LX的基因表达模式相似(斯皮尔曼相关系数为0.86)，揭示了与着色和解毒相关的基因共同参与了一些生物生代谢过程，例如“氨基酸代谢”和“外源生物降解与代谢”。<br>　　研究结果证实了与着色相关的基因和与抗药性相关的基因存在联系，且初步揭示了桔小实蝇5个品系的抗药性差异主要来源于“氨基酸代谢”和“外源生物降解与代谢”，并从中确定了9个候选基因用于后续试验，分别为多巴色素转化酶家族DEC的4个yellow基因(MK529912、MK529913、MK529914和MK529915)、芳烷基胺乙酰转移酶AANAT基因MK515144、多巴脱羧酶DDC基因MK515141、酚氧化酶PO基因MK515140、酚氧化酶laccase2基因MK515143和细胞色素P450基因MK515142。<br>　　3桔小实蝇5个品系蛹和成虫的乙酰胆碱酯酶AChE、谷胱甘肽S-转移酶GST和细胞色素P450的活性比较<br>　　本研究对桔小实蝇5个品系蛹和成虫的乙酰胆碱酯酶AChE、谷胱甘肽S-转移酶GST和细胞色素P450的活性进行测定，得到如下三部分结果和结论：(1)AChE在伴性品系LC和伴性品系LX成虫中的活性分别为155.44μg/mgprot和309.75μg/mgprot，均低于其它在3个品系成虫中的活性，AChE在白色品系蛹的活性高于在褐色蛹色品系蛹的活性，例如在CB品系中的活性最高(335.84μg/mgprot)，说明AChE可以有助于提高桔小实蝇的抗药性，蛹色白色着色可能有助于提高成虫抗药性。(2)谷胱甘肽S-转移酶GST在白化突变品系CB和伴性品系LC蛹中的活性分别为167.94μmol/min/mgprotein和290.86μmol/min/mgprotein，均高于在敏感品系CK和伴性品系LX蛹中的活性，在白化突变品系CB和伴性品系LC成虫中的活性分别为145.98μmol/min/mgprotein和185.35μmol/min/mgprotein，均高于在敏感品系CK和伴性品系LX成虫中的活性，在CZ品系成虫的活性大小为224.01μmol/min/mgprotein，高于在其他4个品系成虫的活性，说明GST可以促进桔小实蝇的抗药性，而且蛹色白化有助于提高成虫抗药性。(3)P450在LC品系成虫中活性为3.14pmol/min/mg，均显著高于在其它4个品系成虫，但LC品系成虫在药效试验中对阿维菌素、高效氯氰菊酯表现出较低抗性，说明存在除P450外的其它可以促进桔小实蝇抗药性的因素。<br>　　4桔小实蝇5个品系蛹和成虫的9个候选基因表达量<br>　　我们基于桔小实蝇转录组分析结果，对9个候选基因的功能有初步了解，并且依据这些功能，对这9个基因在桔小实蝇5个品系蛹和成虫的表达量测定结果进行分析，从而推测这9个基因的作用。结果表明，多巴色素转化酶家族的4个yellow基因(MK529912、MK529913、MK529914、MK529915)、1个芳烷基胺乙酰转移酶AANAT基因(MK515144)、1个多巴脱羧酶DDC基因(MK515141)、1个酚氧化酶PO家族的基因(MK515140)和1个P450基因(MK515142)可以促进桔小实蝇对阿维菌素和高效氯氰菊酯的抗性，1个酚氧化酶laccase2基因(MK515143)可以促进桔小实蝇对敌百虫的抗性。<br>　　5yellow基因MK529913、MK529915和AANAT基因MK515144在桔小实蝇5个品系中肠中的表达量<br>　　本研究对与着色相关的多巴色素转化酶家族DEC的2个yellow基因(MK529913、MK529915)和芳烷基胺乙酰转移酶AANAT基因MK515144在桔小实蝇5个品系成虫中肠的表达量进行了测定，yellow基因MK529913在CZ品系中肠的表达量为CK品系的1.89倍，AANAT基因MK515144在抗性品系CZ中肠的表达量显著为敏感品系的2.64倍，yellow基因MK529915在伴性品系LX品系中肠的表达量为敏感品系的16.28倍，显著高于其它4个品系，AANAT基因MK515144在白蛹色品系(白化突变品系CB、伴性品系LC)中肠及伴性品系LX品系的表达量分别为敏感品系的2.93倍、2.24倍和6.13倍，均显著高于在敏感品系CK中肠的表达量。这些结果表明，上述3个基因可以促进桔小实蝇的抗药性，且在中肠中发挥着重要作用。<br>　　6药剂处理对桔小实蝇成虫和中肠AChE和GST活性的影响<br>　　本研究采用阿维菌素、高效氯氰菊酯和敌百虫对桔小实蝇敏感品系CK进行处理，并对药剂处理后的桔小实蝇成虫和中肠的乙酰胆碱酯酶AChE和谷胱甘肽S-转移酶GST活性进行了测定，得如到如下两部分结果和结论：(1)桔小实蝇在受到这3种药剂的6h、12h和24h作用时，其成虫虫体AChE活性均会得到增强，其中，在受到阿维菌素的30min和24h作用时，其成虫虫体的AChE活性分别为143.50μg/mgprot和237.79μg/mgprot，均显著高于对照组，说明AChE参与了桔小实蝇对药剂的代谢过程。(2)在短期(30 min)敌百虫作用下，桔小实蝇成虫虫体的GST活性为113.53μmol/min/mgprotein，显著高于对照组；在长时间(12h及以上)的阿维菌素、高效氯氰菊酯或敌百虫作用下，桔小实蝇中肠的GST活性普遍得到增强，说明GST可以促进桔小实蝇对敌百虫代谢过程。<br>　　73种药剂处理对成虫及中肠的AANAT基因MK515144、yellow基因MK529913和MK529915表达的影响<br>　　采用阿维菌素、高效氯氰菊酯和敌百虫对桔小实蝇敏感品系CK进行处理，并对经药剂处理的桔小实蝇成虫和中肠的AANAT基因MK515144、yellow基因MK529913和yellow基因MK529915的表达进行测定，得如到如下三部分结果和结论：<br>　　(1)桔小实蝇在受到阿维菌素和敌百虫的30min作用时，其成虫的AANAT基因MK515144的表达量发生升高，分别对照组的1.12倍和1.27倍，而后在受到这两种药剂的12h作用时，其成虫的AANAT基因MK515144的表达量再次升高，为对照组的1.47倍和1.13倍，桔小实蝇在受到药剂作用的6h，其中肠的AANAT基因MK515144表达量在受到阿维菌素、高效氯氰菊酯和敌百虫处理后的桔小实蝇中肠的表达量分别为对照组的1.11倍、1.15倍和1.29倍，证明了AANAT基因MK515144参与了桔小实蝇对阿维菌素、高效氯氰菊酯和敌百虫的反应和代谢过程。<br>　　(2)桔小实蝇在受到敌百虫30min的作用时，其成虫虫体和中肠的yellow基因MK529913相对表达量均显著高于未经药剂处理的对照组，分别为1.58倍和2.42倍，桔小实蝇成虫虫体受到阿维菌素、高效氯氰菊酯和敌百虫的作用时，yellow基因MK529913在中肠的表达量变化比虫体的表达量变化大，例如这个基因在受敌百虫30min作用的桔小实蝇成虫中肠的表达量为显著上升至对照组的2.42倍，而这个基因在受敌百虫30min作用的桔小实蝇成虫虫体中的表达量仅为对照组的1.58倍，证明了yellow基因MK529913参与了桔小实蝇对阿维菌素、高效氯氰菊酯和敌百虫的反应和代谢过程，且在中肠部位发挥着重要作用。<br>　　(3)桔小实蝇在受到敌百虫30min作用时，成虫虫体基因MK529915相对表达量显著高于未经药剂处理的对照组，为对照组的1.15倍，在桔小实蝇受到敌百虫6h和12h作用时，桔小实蝇中肠基因MK529915相对表达量显著高于对照组，分别为对照组的1.46倍和1.81倍，证明了yellow基因MK529915参与了桔小实蝇对敌百虫的反应和代谢过程，而且中肠部位发挥着重要作用。