检索历史 清除

摘要光呼吸是植物特别是C3植物在含氧环境中正常生长所不可或缺的代谢过程，但同时耗费大量能量，成为制约作物产量的重要因子。植物进化到今天，光呼吸途径不单单是一个脱毒和碳骨架回收过程，它已经和植物的碳代谢、氮代谢、硫代谢等整合。参与光呼吸的基因在突变后大多呈致死表型，而质体甘油酸/乙醇酸转运体基因(AtLrgB/PLGG1)突变后，只呈叶片花斑表型，在大气环境中可以正常生长，极具研究价值。本研究以此为切入点，探求atlrgB突变体表型形成的原因以及AtLrgB基因的基因互作网络。获得的主要结果如下：<br>　　1.光照对atlrgB突变体表型的影响<br>　　将野生型和atlrgB突变体置于普通光照和强光照下处理，6d、9d、12d、15d分别取样测量鲜重，结果发现，普通光照下，野生型和atlrgB的鲜重差距很小，而强光照条件下，野生型的鲜重从第9天开始与atlrgB突变体差距拉大，说明强光增加了植物的光呼吸，使atlrgB突变体的生长受到更严重的抑制。<br>　　2.atlrgB抑制突变体的探究<br>　　利用EMS诱变技术获得了atlrgB的抑制突变体，并通过MBS(mapping-by-sequencing)测序定位技术定位到了四个抑制基因，Col-0背景下的三个分别为：色氨酸合成酶B1亚基(TSB1)、叶绿体乙酰辅酶A合成酶(ACS)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(PGM )，WS-2背景下的为羟基异丁酸辅酶A水解酶(HIBH)。构建了四个基因的表达载体进行了回复验证，并重点研究了AtLrgB与PGM间的互作关系。结果表明，atlrgB花斑的形成可能与植物色氨酸的合成、脂肪酸的合成、淀粉的合成、支链氨基酸的分解等途径相关。<br>　　3.AtLrgB与PGDH2、ENO、PPT基因的互作<br>　　细胞核编码的叶绿体蛋白磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH2)、磷酸烯醇丙酮酸烯醇酶(ENO1)、磷酸烯醇丙酮酸/磷酸转运体(PPT)参与色氨酸和脂肪酸的合成。利用CRISPR/Cas9技术和杂交等过程获得三种基因的单突变体以及与AtLrgB基因的双突变体，初步观察了表型。结果表明，AtLrgB对PGDH2、ENO1起隐性上位作用，而PPT对AtLrgB呈隐性上位。三种基因与AtLrgB的双突变体的鲜重均明显小于野生型，说明植物的生长依赖于色氨酸、脂肪酸的合成及其代谢，但同时证明PGDH2、ENO1、PPT不能抑制叶片花斑的形成。<br>　　4.AtLrgB与GLYK基因的互作<br>　　编码甘油酸激酶的GLYK基因是AtLrgB的下游基因，有两个转录本，ptGLYK编码的蛋白有叶绿体定位导肽，cytGLYK编码的蛋白没有导肽，只能定位于细胞质。利用CRISPR/Cas9技术对GLYK基因进行编辑，获得了十种不同突变形式的突变体，均有肉眼可见的表型。对野生型和纯合突变体进行了ptGLYK和cytGLYK的定量检测，以及突变后的蛋白序列预测和表型分析，结果表明，单敲除ptGLYK的植株就表现为致死，cytGLYK的表达量提高得越多，植株的生物量就越大，说明细胞质甘油酸快速降解能部分弥补叶绿体甘油酸降解的缺陷。<br>　　以上四个结果整合起来表明：(1)和PPT相比，AtLrgB对丝氨酸和色氨酸合成途径的贡献有限；(2)和致死的glyk突变体相比，atlrgB突变体不致死的原因在于累积在细胞质中的甘油酸可以被cytGLYK转化从而获得一定的耐受力；(3)强光条件下提高细胞质的甘油酸转化，可能是植物耐强光耐高温(高光呼吸逆境)遗传改良的有益途径。