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摘要蜘蛛丝因其优异的力学性能和良好的生物相容性，近年来一直受到研究人员的广泛关注。圆网蜘蛛具有7种类型的产丝腺体，能够分泌6种丝纤维以及一种湿胶，而且每种丝纤维都表现出独特的生物学功能和材料学特性。在这些类型的丝纤维中，管状腺丝(Tubuliform silk)主要用于形成卵袋的外层丝，并保护卵袋内的蜘蛛卵免受外界环境的干扰，具有良好的韧性及断裂强度。而葡萄状腺丝(Aciniform silk)在所有类型的蛛丝中具有最强的韧性，用于对猎物的包裹及形成卵袋的内层结构。正因为蛛丝的这些优良的材料学特性，因此在组织工程、航空航天和军事等领域具有巨大的应用价值。然而，由于蜘蛛同类相食的天性及自身产丝量低等因素，从而难以对蜘蛛进行大规模饲养获取丝纤维。因此，利用生物技术手段制备仿生蛛丝便成为获取蛛丝纤维的主要途径。<br>　　随着国内外研究人员对蛛丝蛋白不断地深入研究，已有关于蛛丝蛋白基因的鉴定被陆续地报道。然而，由于蛛丝基因大，重复序列长且复杂和GC含量高，因此所报道的蛛丝基因大多数为片段化的序列，只有少量的蛛丝蛋白全长基因被测序鉴定。另外，之前研究人员通过构建基因组文库或cDNA文库，对包含蛛丝基因的阳性克隆进行筛选蛛丝而获取全长编码基因序列。此方法尽管能从基因组DNA中钓取完整的目的基因，但因其具有盲目性、专一性差和效率低下等缺点，严重滞后了对蛛丝蛋白全长基因序列的研究进展。蛛丝蛋白全长基因序列的稀缺性不仅无法满足高性能仿生蛛丝纤维制备的需要，同时也限制了对蛛丝基因分子进化机制的进一步了解。此外，由于对天然蛛丝的成丝机理了解有限，导致目前的纺丝方法所制备的仿生蛛丝纤维的力学性能与天然蜘蛛丝有着很大差距。因此，改良纺丝工艺，选择合适的纺丝试剂对于提升仿生蛛丝性能具有重要意义。<br>　　本论文以大腹园蛛(Araneus ventricosus)管状腺丝(Tubuliform spidroin, TuSp)和葡萄状腺丝(Aciniform spidroin, AcSp)为研究对象，利用简并PCR、锚定PCR、长距离PCR(LR-PCR)以及RACE等一系列PCR技术，克隆出三条蛛丝蛋白全长编码基因，为高性能仿生蛛丝的制备提供了新的基因蓝图，进一步揭示了蛛丝蛋白的多样性，为研究蛛丝基因的分子进化机制提供更多详实的数据。同时，本论文还构建并表达了两类重组蛛丝蛋白，系统地研究了蛋白分子量以及纺丝试剂对丝纤维性能的影响，并制备出了高性能仿生蛛丝纤维，为今后在生物医学材料领域的应用奠定了坚实的理论基础。<br>　　本论文的研究内容主要由以下五个课题组成：<br>　　1.蛛丝蛋白TuSp1全长编码基因结构分析。作为一种用于构建蜘蛛卵袋外层结构的丝纤维，由管状腺体所分泌的管状腺丝具有良好的力学性能，同时能够抵御卵袋外部环境对蜘蛛卵的侵袭，例如温度的变化以及有害微生物等。因此，对于管状腺丝的研究对制备出具有良好材料学特性的新型生物材料具有重要的意义。在本章中，利用简并PCR、锚定PCR以及LR-PCR技术，从A.ventricosus基因组DNA中成功地克隆并鉴定出A.ventricosusTuSp1全长编码基因。对该全长基因序列分析后，结果显示该基因长达5763bp，共编码1921个氨基酸。没有检测到内含子。此外，其重复区内具有9个在序列上彼此相似度极高的重复单元。丝氨酸(Ser)与丙氨酸(Ala)是TuSp1中最为丰富的氨基酸，分别占27.9%和23.8%。二级结构预测结果表明该蛋白的NT和CT各自存在5个α-螺旋(α-helix)结构。A.ventricosusTuSp1的疏水性预测结果显示，该蛋白总体上表现出较强的疏水性。对A.ventricosusTuSp1全长基因序列的鉴定不仅能够为仿生蛛丝的制备提供更多的基因资源，而且对于了解长且带有重复序列的基因的分子进化动力学也至关重要。<br>　　2.探索TuSp1重组蛛丝蛋白的外源表达以及纺丝纤维的性能。在上一研究获得TuSp1基因序列之后，利用外源宿主表达重组蛋白并制备相应的仿生蛛丝便成为了研究重点。在本章中，将TuSp1的NT和CT结构域与1~4个TuSp1的重复单元(Rp)进行嵌合，构建了4个含有不同重复单元数量的重组蛛丝蛋白NTR1-4CTTuSp1。4种重组蛋白在大肠杆菌(E. coli)中的表达结果显示，随着重复单元的增加，蛋白的产量随之减少。此外，具有4个重复单元的蛋白NTR4CTTuSp1没有表达，而且NTR1-3CTTuSp1都表达在包涵体中。由于NTR2-3CTTuSp1的产量低，且纯化较为困难，因此以NTR1CTTuSp1为代表制备重组蛛丝纤维。二次拉伸已被证明可以提高人造丝纤维的品质。虽然NTR1CTTuSp1蛋白的分子量小只有50kDa，但NTR1CTTuSp1纯化后溶解在六氟异丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluro-2-propanol, HFIP)中，在凝固浴中进行湿纺及二次拉伸之后，力学性能测试结果表明二次拉伸得到的丝纤维具有约400MPa的断裂强度，几乎和天然包卵丝相当，韧性可达100MJ/m3。本章以分子量较小的NTR1CTTuSp1蛋白为原料所制备的仿生蛛丝综合性能优良，证明了A.ventricosusTuSp1对于生产高品质生物材料是一种非常理想的蛛丝基因。同时，为了纺织出性能更为优越的丝纤维，仍需在密码子优化和表达宿主方面进行研究以提高其余三种重组蛋白的产量。<br>　　3.葡萄状腺丝蛋白AcSp1全长基因的克隆及分析。葡萄状腺丝在蜘蛛的繁殖和捕食过程中都具有重要作用，主要用于包裹猎物以及形成卵袋内层丝结构。同时，因其兼具高强度和高延展性，因此在所有类型的蛛丝中具有最强的韧性。本章利用上述的PCR技术，成功地克隆并测序了AcSp1全长编码基因序列，其序列显示该基因可达10338bp，编码3445个氨基酸。其重复区由15个长且复杂的重复单元所组成，并且这些重复单元之间具有极高的序列相似度。相较于TuSp1，AcSp1中Ser(18.0%)与Ala(12.6%)含量较低，而甘氨酸(Gly)含量有所提高，达到14.5%。AcSp1的二级结构预测表明，其NT端存在5个α-螺旋，而CT端只包含4个α-螺旋。系统进化树的结果显示，AcSp1与TuSp1基因很有可能起源于一个共同的祖先丝基因，在经过数亿年的进化后，形成各自高度分化的丝基因。对于A.ventricosusAcSp1基因序列的克隆分析不仅有助于更为深入地了解不同蛛丝基因之间的演化历史，而且还为制造出高韧性的仿生丝纤维提供了可利用的基因资源。<br>　　4.新型蛛丝蛋白AcSp2全长基因的结构特征。尽管圆网蜘蛛能够分泌出7种不同类型的丝纤维，但作为蛛丝纤维的主要成分-蛛丝蛋白来说，其种类极其多样。棒络新妇蜘蛛(Nephila clavipes)全基因组测序结果显示，至少存在8种大壶腹腺丝蛋白(MaSp)基因以及4种小壶腹腺丝蛋白(MiSp)基因。然而，目前仍然只发现了一种类型的葡萄状腺丝蛋白基因，即AcSp1。尽管不同蜘蛛的AcSp1基因在序列上有些许差异，但无论是NT端、CT端以及重复区仍具有较高的同源性。本章将RACE技术与简并引物相结合，通过LR-PCR成功鉴定出了第二种类型葡萄状腺丝蛋白全长编码基因，命名为AcSp2。AcSp2的全长基因大小为14238bp，编码的蛋白有4745个氨基酸，分子量为476kDa。该蛋白的重复区由25个重复单元组成，前24个重复单元长度在183~185个氨基酸之间，最后一个为截断的重复只有11个氨基酸。同时，这些重复单元的序列与AcSp1相似度极低，表明这是一种新型的重复模块，而且一些重复单元存在序列丢失的现象，即缺少一个丝氨酸和一个天冬氨酸。然而，其NT端和CT端序列与AcSp1具有较高的同源性。遗传进化分析结果显示，AcSp2与AcSp1在遗传距离上相距较远，但AcSp2基因仍然处于AcSp分支上，表明AcSp2基因可能在遥远的过去由AcSp1基因分化而来，之后进行着各自的演化道路。在本章中，首次证实了第二种类型的葡萄状腺丝蛋白的存在，表明蛛丝蛋白基因的分化事件在蜘蛛的进化史及不同类型蛛丝蛋白中普遍发生。<br>　　5.纺丝溶剂及重复单元数量对AcSp2重组蛛丝性能的影响。天然蛛丝纤维的力学性能主要取决于蛛丝蛋白内的重复区序列。重复序列的类型及大小都能极大地影响丝纤维的力学性能。对于仿生蛛丝而言，纺丝溶剂及重复单元数量都能极大地改变丝的品质。本章依据上述所获得的AcSp2全长基因，将AcSp2的NT端、CT端以及1~6个重复单元进行基因重组，构建了6种具有不同重复单元数量的AcSp2的重组蛋白基因，并在E.coli内对6种蛋白进行表达。以纯化的重组蛋白为蛋白原料，通过湿纺法制备了不同的仿生丝纤维。力学性能测试结果显示，重复单元数量的增加能够提升丝纤维的延展性，而对于丝的强度影响不大。同时，利用不同溶剂进行纺丝的结果表明，当以HFIP为溶剂，水为凝固浴进行纺丝时，纺出的丝纤维更细。尽管其丝纤维的断裂强度较弱，但其延展性获得极大提高，可达161%且超越了天然的包裹丝。本章不仅制备出超越天然蛛丝的高延展性的仿生蛛丝纤维，而且为制备具有优良力学性能的仿生蛛丝提供了新的思路。