检索历史 清除

摘要组蛋白翻译后修饰(Histone Post-translational Modification， HPTM)是表观遗传学的重要内容之一，在基因转录、翻译等生物学过程中发挥重要作用。目前的研究表明：组蛋白修饰可以招募具有识别结构域的结合蛋白(reader)及其复合物，从而调控基因转录，决定细胞命运。因此，组蛋白修饰与其识别蛋白相互作用的精确表征对于理解组蛋白修饰调控功能至关重要。然而由于组蛋白修饰动态变化、形式复杂，特别是近年来新修饰的大量涌现，以及组蛋白修饰与结合蛋白作用力弱，常常发生在瞬时等特点，都为揭示二者互作，特别是多元复杂作用带来了挑战。本论文旨在发展组蛋白修饰与识别蛋白的系统分析新方法，研究二者的多元复杂作用，探索新修饰对结合的影响，为理解组蛋白修饰介导的蛋白复合物及其生物学意义提供新思路。本论文分为两个部分：(一)建立基于质谱技术的集成方法表征组蛋白双修饰与BPTF串联结构域的相互作用。通过构建识别蛋白结构域和组蛋白修饰多肽库，研究结构域对修饰的识别，并结合高灵敏质谱鉴定，表征组蛋白二元修饰与串联识别结构域的作用。在筛选的基础上，采用等温热量滴定测量其结合力及热力学常数，进而考察其结合的特异性。从而发现了BPTF的串联结构域PHD-Bromo与组蛋白H3K4me3K14ac具有较强的特异性结合。通过邻近连接实验，进一步证明了它们在细胞内的共定位，借助分子动力学模拟证明了组蛋白H3K14ac和H3K4me3两种修饰之间存在协同作用。研究结果表明，我们采用的分析策略在组蛋白修饰与结合蛋白多元复杂作用的表征和鉴定方面是十分有效的。(二)组蛋白修饰与串联结构域识别蛋白及结合蛋白互作网络的鉴定及生物学意义研究。我们构建并表达了BPTF-PHD-Bromo、CBP-Bromo-PHD、TRIM24-PHD-Bromo、TRIM33-PHD-Bromo和TAF1-Bromo-Bromo等串联结构域蛋白，利用质谱筛选和等温热量滴定分析，研究了它们与组蛋白修饰的多元复杂作用。发现了各串联结构域与组蛋白修饰的作用关系，但是通过等温热量滴定量发现BPTF-PB对双修饰多肽较好结合作用，进而我们利用串联结构域蛋白对293T细胞核蛋白进行亲和富集和质谱分析，针对鉴定的结合蛋白复合物的生物信息学分析，研究了结合蛋白的特征，并建立了组蛋白修饰-识别结构域-结合蛋白复合物多元复杂作用的分子网络关系。经过筛选及聚类分析，我们发现MYBBP1A；HELLS；PRKDC；CREBBP这四个差异基因，可能直接参与了组蛋白翻译后修饰。我们的研究为理解组蛋白修饰、识别蛋白、以及复合物之间的生物学意义提供了新的信息。