LncRNA HULC/miR-372-3p/Rab11a环路调控肝细胞癌外泌体分泌机制的研究-论文-万方医学网

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LncRNA HULC/miR-372-3p/Rab11a环路调控肝细胞癌外泌体分泌机制的研究

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摘要目的： 　　探索lncRNAHULC能否作为术前肝细胞癌诊断标志物以及其调控外泌体分泌过程的分子机制，进一步完善HULC转录水平的肝细胞癌调控网络。 　　方法： 　　一、肝细胞癌血清和细胞系外泌体的提取及鉴定方法学建立 　　1.肝细胞癌患者血清外泌体提取与鉴定 　　(1)运用血清外泌体提取试剂盒，提取肝细胞癌患者术前血清外泌体； 　　(2)透射电镜观察外泌体大小与形状； 　　(3)Westernblot检测外泌体表面蛋白标志物CD63和TSG101； 　　(4)纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle tracking analysis，NTA)精确检测外泌体直径和浓度。 　　2.肝癌细胞系培养基外泌体提取与鉴定 　　(1)运用肝癌细胞培养基外泌体试剂盒，提取肝癌细胞系外泌体； 　　(2)运用透射电镜观察外泌体大小与形状； 　　(3)运用Westernblot检测外泌体表面蛋白标志物CD63和TSG101； 　　(4)运用NTA精确检测外泌体直径和浓度。 　　二、肝癌患者血清、血清外泌体和组织中HULC的表达检测及分析 　　1.样本选取 　　本研究中，选取了天津市第一中心医院于2017年1-8月手术的30例肝细胞癌患者，收集血清和组织样本，统计临床信息(年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化和TNM分期)，血清对照组为天津市第一中心医院健康体检病人，组织对照组为癌旁组织。均通过伦理审核。 　　纳入标准为：(1)完整的临床资料；(2)患者术前未接受化疗、放疗或免疫治疗。排除标准为：(1)缺乏临床资料；(2)肿瘤组织坏死面积＞60%；(3)伴有其他恶性肿瘤。 　　2.目的lncRNA选取 　　选取肝癌细胞系外泌体中现有报道4个lncRNA(lncRNAROR、VLDLR、TUC339和H19)和一个肝细胞癌经典lncRNAHULC，于肝细胞癌患者血清外泌体中进行临床检测。 　　3.目的lncRNA的提取 　　SeraMirExosomeRNA试剂盒提取血清外泌体中总RNA，TRIzol试剂的方法提取血清及组织中总RNA。实时定量荧光核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)方法检测肝细胞癌患者血清、血清外泌体和组织中目的lncRNA表达。 　　4.统计学分析 　　运用χ2检验统计学方法分析目的lncRNA与肝细胞癌患者临床特征(年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化和TNM分期)的相关性。 　　三、HULC对肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用 　　1.高表达、低表达HULC肝癌细胞模型建立 　　(1)选取肝癌细胞系HepG2和SMMC7721进行基础实验。qPCR检测肝癌细胞系HepG2和SMMC7721中HULC表达水平； 　　(2)向肝癌细胞系转染HULC过表达及HULC-siRNA质粒建立肝癌细胞高表达、低表达HULC细胞模型。 　　2.使用细胞增殖实验(Cell Counting Kit-8 ，CCK8)检测HULC对肝癌细胞的增殖作用。 　　3.Transwell实验检测HULC对肝癌细胞侵袭的作用。 　　4.凋亡实验(TdT - mediated dUTP Nick - End Labeling，TUNEL)检测HULC对肝癌细胞凋亡的作用。 　　四、HULC/miRNA-372-3p/Rab11a通路对肝癌细胞外泌体分泌的影响 　　1.HULC与miRNA-372-3p的作用关系 　　(1)qPCR检测转染HULC后miRNA-372-3p表达水平； 　　(2)使用双荧光素酶报告基因(Dual-Luciferase reporter assay)检测HULC与miRNA-372-3p的序列结合情况。 　　2.Rab11a与miRNA-372-3p的作用关系 　　(1)qPCR检测转染miRNA-372-3p后Rab11a表达水平； 　　(2)使用双荧光素酶报告基因检测miRNA-372-3p与Rab11a的序列结合情况。 　　3.miRNA-372-3p挽救实验 　　共转染HULC-siRNA和miRNA-372-3p-siRNA质粒同单独转染HULC-siRNA质粒于肝癌细胞后，Westernblot检测蛋白Rab11a的变化。 　　4.HULC、miRNA-372-3p和Rab11a对肝癌细胞外泌体分泌的调节作用。 　　NTA检测转染HULC过表达质粒、miRNA-372-3p-siRNA和Rab11a过表达质粒后，肝癌细胞系外泌体分泌量。 　　结果： 　　一、肝细胞癌血清和细胞系外泌体成功提取 　　从肝细胞癌患者血清和肝癌细胞培养基中成功提取外泌体。 　　1.利用透射电镜观察外泌体形状和大小均相同，具有囊泡球形外体的特征性外观。 　　2.NTA计算的外泌体直径的中位值大小为106.9nm符合文献报道外泌体直径30-120nm大小的范围。 　　3.Westernblot检测TSG101和CD63外泌体标记物的表达。 　　综上证实分离的小泡确实是外泌体。 　　二、肝细胞癌患者血清、血清外泌体和组织中HULC的表达检测及分析。 　　本研究中30名患者(9名男性和21名女性)，平均年龄53.9±16.2岁。 　　1.5种lncRNA进行肝细胞癌外泌体中临床检测，lncRNAROR和lncRNAHULC均显著高于对照组，ROR作为今后实验对象，本文选取HULC进行实验研究。 　　2.肝细胞癌患者血清中HULC的表达高于对照组(P＜0.05)。肝细胞癌患者血清外泌体中HULC的表达高于对照组(P＜0.05)。同时，肝细胞癌患者血清外泌体中HULC的表达与患者TNM分期相关(P＜0.05)。此外，肝细胞癌患者血清外泌体中HULC表达检测ROC曲线下面积AUC=0.801＞肝细胞癌血清直接检测HULC的ROC曲线下面积AUC=0.645。 　　3.肝细胞癌组织中的HULC水平高于癌旁组织(p＜0.05)。同时HULC在组织中的表达与外泌体中表达相关，具有统计学意义(r=0.633，p＜0.05)。 　　三、HULC对肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用 　　1.高表达、低表达HULC肝癌细胞模型建立 　　选取肝癌细胞系HepG2和SMMC7721，qPCR结果显示HULC表达肝癌细胞HepG2和SMMC7721均明显高于正常组。转染HULC过表达及HULC-siRNA质粒至HepG2和SMMC7721细胞后，成功建立高表达、低表达HULC肝癌细胞模型。 　　2.细胞增殖实验CCK8检测，观察到HULC过表达促进HepG2和SMMC7721细胞的生长。 　　3.Transwell实验中检测了HULC对肝癌细胞侵袭能力的影响，HULC增强HepG2和SMMC7721细胞侵袭性。 　　4.TUNEL分析显示，HULC显著抑制HepG2和SMMC7721细胞凋亡。 　　四、HULC/miRNA-372-3p/Rab11a通路对肝癌细胞外泌体分泌的影响 　　1.HULC吸附并降低了miRNA-372-3p的表达 　　当WT-HULC质粒和miRNA-372-3p-MIMICS共转染到肝癌细胞中时，观察到荧光素酶活性低于MUT-HULC组(p＜0.05)。HepG2和SMMC7721细胞中HULC过表达，miRNA-372-3p的表达水平降低。 　　2.Rab11a是肝癌细胞中miRNA-372-3p的直接靶点 　　在HepG2和SMMC7721细胞中共转染含有WT-Rab11a和miRNA-372-3pinhibitors的荧光素酶报告质粒导致荧光素酶活性高于MUT-Rab11a组(p＜0.05)。此外，miRNA-372-3p抑制增加了Rab11a的表达。 　　3.HULC吸附miRNA-372-3p靶向调节Rab11a 　　为了进一步证实HULC是否能通过miRNA-372-3p/Rab11a轴调控外泌体的分泌，HULC-siRNA和miRNA-372-3p-siRNA质粒被共转染到肝癌细胞中。实验发现HULC降低抑制了Rab11a的表达，而miRNA-372-3p的下调挽救了Rab11a的表达。 　　4.HULC和Rab11a上调以及miRNA-372-3p的下调促进肝癌细胞外泌体分泌NTA检测转染HULC/miRNA-372-3p-siRNA/Rab11a质粒后外泌体量，均 　　明显高于对照组(p＜0.01)。 　　结论： 　　本研究证实了血清外泌体中HULC可作为潜在敏感的肝细胞癌术前标志物，并发现了肝癌细胞系中HULC通过竞争性吸附miR-372-3p调控Rab11a促进肝细胞癌外泌体分泌的作用机制。