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摘要目的：研究沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)pORF5质粒蛋白能否通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制细胞凋亡和促进细胞增殖，提高Ct的感染率，为阐明pORF5质粒蛋白在Ct致病机制中的作用提供实验依据。<br>　　方法：将本课题组前期已构建的pGEX-6p-1/pORF5重组质粒菌接种于LB固体培养基进行培养，进而扩大培养后经0.2mMIPTG诱导后表达GST-pORF5融合蛋白，将融合蛋白经过树脂纯化后用蛋白酶切除标签GST，收集pORF5质粒蛋白并去内毒素。将0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL的pORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞0h、6h、12h、18h、24h后，收集细胞总蛋白和RNA，分别用Westernblot技术和qRT-PCR技术检测HeLa细胞中β-catenin蛋白的表达水平；免疫荧光技术观察β-catenin蛋白的核转位现象。用10μMWnt抑制剂IWP2预处理HeLa细胞1h后，加入凋亡诱导剂TNF-α(25 ng/mL)处理4h，利用Westernblot技术检测β-catenin蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化；用Hoechst33258荧光染色和流式细胞技术检测细胞凋亡情况。以最佳的pORF5质粒蛋白浓度刺激HeLa细胞8h、12h、24h、36h后，CCK-8法检测细胞增殖情况；qRT-PCR检测细胞黏附分子EpCAM和OLFM4的mRNA表达水平。10μMWnt抑制剂IWP2预处理HeLa细胞1h后，Ct血清型E型感染36h，计算Ct子代包涵体数目的变化。<br>　　结果:<br>　　1.pGEX-6p-1/pORF5重组菌经IPTG诱导后表达分子量约54kDa的GST-pORF5融合蛋白；融合蛋白经蛋白酶酶切后，得到不含GST的pORF5质粒蛋白。<br>　　2.β-catenin蛋白的表达量随pORF5质粒蛋白浓度和刺激时间的不同而变化，当15μg/mLpORF5质粒蛋白刺激HeLa细胞18h时，β-catenin蛋白的表达量达到峰值；免疫荧光观察发现：在pORF5蛋白刺激组中，β-catenin蛋白发生明显的核转位；Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWP2可降低β-catenin蛋白的表达并抑制β-catenin蛋白发生核转位。<br>　　3.Westernblot发现，与pORF5质粒蛋白刺激组比较，IWP2/pORF5组能上调Bax表达而下调Bcl-2表达；Hoechst染色结果发现，IWP2/pORF5组与DMSO/pORF5组相比，细胞凋亡率增加了20.3%(P＜0.001)，且抑制剂组细胞核碎裂和核固缩现象明显；流式细胞技术检测结果发现，与DMSO/pORF5组相比，IWP2/pORF5组细胞凋亡率升高了22.08%(P＜0.001)。<br>　　4.20μg/mLpORF5质粒蛋白浓度刺激HeLa细胞18h时，Westernblot检测Bcl-2和Bax的表达，发现Bcl-2表达上调、Bax表达下调；Hoechst染色结果发现，pORF5/TNF-α组凋亡率相比于TNF-α组凋亡率降低了27.9%(P＜0.001)，相比于正常组降低了5.4%(P＜0.01)；流式细胞技术检测结果发现，pORF5/TNF-α组相比于TNF-α组的细胞凋亡率降低了23.26%(P＜0.001)，相比于正常组的细胞凋亡率降低了2.97%(P＜0.05)。<br>　　5.各组在12-36h的细胞增殖活性最大，pORF5质粒蛋白刺激组与IWP2/pORF5组相比，HeLa细胞增殖活性明显增加(P＜0.05)；与空白组相比，细胞增殖活性显著性增加(P＜0.01)；qRT-PCR检测细胞黏附分子的变化发现，pORF5质粒蛋白刺激组与IWP2/pORF5组相比，EpCAM、OLFM4和β-catenin的mRNA水平均增加(P＜0.01)。<br>　　6.免疫荧光观察包涵体，用公式计算得到CtE的子代包涵体数目，其结果显示：正常组的IFU为2.79×107/mL，IWP2抑制剂组的IFU为1.16×107/mL，抑制剂组的IFU显著性降低(P＜0.001)。<br>　　结论:<br>　　pORF5质粒蛋白通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制细胞凋亡和促进细胞增殖，提高Ct的感染率。