施旺细胞源性Sema3b调节周围神经轴突径向排序-论文-万方医学网

施旺细胞源性Sema3b调节周围神经轴突径向排序

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要研究背景 　　施旺细胞是周围神经系统主要的胶质细胞，其在发育过程中沿着轴突分布，并与轴突保持紧密联系。施旺细胞与轴突之间相互作用对于周围神经系统正常结构与功能的维持至关重要。施旺细胞由神经嵴细胞(neural crest cell, NCC)分化发育而来，随着发育的进行，一部分施旺细胞包绕大口径(大于1μm)轴突生成致密的髓鞘，该部分施旺细胞称为髓鞘化施旺细胞(myelinating Schwann Cell，mSC)，相应的轴突称为有髓鞘包绕的轴突(myelinated axon)。有髓鞘包绕的轴突主要与快速神经冲动传导相关，其形成髓鞘的过程称为轴突的myelination。另一部分施旺细胞则不生成髓鞘，而是包绕若干小口径(小于1μm)轴突形成Remakbundle，该部分施旺细胞称为非髓鞘化施旺细胞(non-myelinating Schwann Cell，NMSC)或Remakcell，相应的轴突称为无髓鞘包绕的轴突(unmyelinated axon)。无髓鞘包绕的轴突主要与慢性神经冲动传导相关。施旺细胞通过与轴突相互作用形成髓鞘或者Remakbundle，最终使轴突的分布状态由杂乱无序变为有序排布，该过程称为轴突径向排序(axonal radial sorting)。 　　施旺细胞和轴突相互作用分子调控异常可能导致轴突径向排序发育过程异常，进而影响周围神经的功能。研究表明施旺细胞通过其增殖、分化、极化等方面调控轴突径向排序。虽然以前研究发现neuregulin1(Nrg1)-ErbB2/3信号通路是调控成年周围神经轴突髓鞘生成的关键信号通路，轴突通过其表达的Nrg1typeIII与施旺细胞表达的ErbB2/3受体相互作用进而决定其形成髓鞘的厚度，但是发育阶段控制周围神经轴突径向排序，尤其是NMSC与无髓鞘包绕的轴突相互作用形成Remakbundle的分子通路仍然未知。 　　本课题通过对正常小鼠和清除施旺细胞小鼠的坐骨神经通过mRNA测序比对发现，Sema3b基因特异性表达于施旺细胞。现有研究表明semaphorin家族在抑制神经元轴突的延伸以及通过凋亡抑制肿瘤等方面起重要作用。Sema3b基因作为semaphorin家族成员之一，目前研究表明该基因主要作为肿瘤抑制子，通过诱导凋亡抑制肿瘤如乳腺癌、肺癌、肾癌的发生，但是Sema3b基因在轴突径向排序发育过程的分子调控作用尚未有报道。 　　目的及意义 　　本研究以小鼠为研究模型，综合利用免疫荧光、原位杂交、透射电镜、mRNA-seq、Sema3b基因敲除小鼠动物模型、Nrp1基因敲除动物模型、行为学测试以及体外培养等技术手段，探究施旺细胞源性Sema3b基因在轴突径向排序发育过程中的分子机制，旨在为轴突径向排序发育过程的分子调控及相关神经病理性疾病的发病机制研究调控提供新的视角。 　　方法 　　1.系统观察轴突径向排序发育过程 　　(1)以抗体NF200和peripherin分别标记myelinatedaxon和unmyelinatedaxon,抗体MBP标记髓鞘，检测轴突myelination的发育进程； 　　(2)以常规透射电镜观察Remakbundle的发育进程。 　　2.针对坐骨神经的mRNA-seq筛选并锁定特异表达于施旺细胞的目标分子 　　(1)在P4DhhCre;R26iDTR转基因小鼠腹腔注射适量白喉毒素特异性杀死施旺细胞作为ΔSC组(SC：Schwanncell，施旺细胞)，DhhCre或R26iDTR转基因小鼠注射相同剂量白喉毒素作为Control组，每两天给药一次； 　　(2)取P14Control和ΔSC小鼠坐骨神经利用mRNA测序以筛选锁定特异表达于施旺细胞的目标分子Sema3b基因； 　　(3)FISH和免疫荧光验证Sema3b基因在施旺细胞表达的特异性。 　　3.构建Sema3b基因敲除小鼠动物模型，检测该基因在轴突径向排序发育过程的作用 　　(1)构建Sema3b基因条件性敲除(Sema3b CKO)小鼠，检测该基因敲除效率； 　　(2)电镜观察Sema3bCKO小鼠坐骨神经轴突径向排序； 　　(3)行为学检测Sema3bCKO小鼠行为学表型。 　　4．构建Sema3b基因诱导性敲除(Sema3b iCKO)小鼠动物模型，确定Sema3b基因在轴突径向排序发育过程中起作用的关键时间点 　　(1)在轴突径向排序发育进程中，诱导性敲除Sema3b基因小鼠坐骨神经轴突径向排序； 　　(2)在轴突径向排序发育完成后，诱导性敲除Sema3b基因小鼠坐骨神经轴突径向排序。 　　5．Sema3b基因的受体neuropilin1(Nrp1)基因敲除小鼠的表型验证 　　6．体外培养施旺细胞-轴突共培养以验证施旺细胞是否通过Sema3b-Nrp1/2信号通路调控轴突径向排序发育过程 　　结果 　　1.轴突径向排序发育过程在小鼠出生28天(P28)完成 　　(1)免疫荧光观察到P28小鼠坐骨神经中几乎所有NF200+的myelinatedaxon被MBP+髓鞘所包绕； 　　(2)电镜观察到P28小鼠坐骨神经Remakbundle中几乎所有unmyelinatedaxon被施旺细胞的胞质完全分离。 　　2.Sema3b是特异性表达于施旺细胞的目标分子 　　(1)mRNA测序结果比对分析发现，ΔSC组中Sema3b表达量显著低于Control组； 　　(2)FISH检测结果表明Sema3b特异性表达于施旺细胞； 　　(3)免疫荧光检测结果表明Sema3b特异性表达于NMSC。 　　3．Sema3b条件性敲除(Sema3b CKO)小鼠坐骨神经出现轴突径向排序缺陷 　　(1)Sema3bCKO小鼠坐骨神经中施旺细胞数目未改变； 　　(2)电镜观察到Sema3bCKO小鼠坐骨神经中，Remakbundle存在大量口径大于1μm的unmyelinatedaxon； 　　(3)免疫荧光试验确定Sema3bCKO小鼠坐骨神经Remakbundle中存在的无髓鞘包绕的大口径轴突为NF200阳性； 　　(4)行为学测试显示Sema3bCKO小鼠的运动能力不受影响，但对机械刺激及热刺激敏感性阈值降低。 　　4．施旺细胞源性Sema3b调节了轴突径向排序的发育进程 　　(1)利用Sema3biCKO小鼠，在轴突径向排序完成前敲除Sema3b，小鼠坐骨神经出现轴突径向排序缺陷； 　　(2)利用Sema3biCKO小鼠，在轴突径向排序完成后敲除Sema3b，小鼠坐骨神经的轴突径向排序完全正常。 　　5．Sema3b基因的受体neuropilin1(Nrp1)基因敲除小鼠表现出轴突径向排序缺陷表型 　　(1)FISH检测到Nrp1/2表达于感觉轴突； 　　(2)Nrp1基因敲除小鼠检测到轴突径向排序缺陷。 　　6．施旺细胞-轴突共培养证明施旺细胞通过Sema3b-Nrp1信号通路调控轴突径向排序发育过程 　　结论 　　本课题观察到轴突径向排序发育过程在小鼠出生28天完成；Sema3b基因特异性表达于NMSC，其受体Nrp1/2则表达于感觉轴突；Sema3bCKO小鼠和Nrp1CKO小鼠坐骨神经中轴突径向排序出现阻滞/延迟现象；体外培养证明了施旺细胞通过Sema3b-Nrp1/2信号通路调控径向排序发育过程。本项研究揭示了Sema3b基因对轴突径向排序的分子调控作用，并为进一步研究径向排序的分子调控机制奠定基础。