摘要研究目的<br> 胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,2018年统计确诊的胃癌新发病例就超过100万例。在中国胃癌的发病率和死亡率均高居恶性肿瘤的第2位。胃癌发病隐匿,不易早期发现,预后极差。抑癌基因的表观遗传异常是胃癌发生的重要机制之一,尤以DNA甲基化最为普遍。DNA甲基化修饰是导致抑癌基因失活的主要原因之一。筛选出因表观遗传改变而失活的抑癌基因,明确其作用机理,将有助于了解胃癌发生发展,为将来的临床诊治研究提供方向。<br> 通过高通量甲基化芯片检测,我们发现eIF4EBP3是胃癌中的甲基化基因。然而,尚未有研究探讨eIF4EBP3在胃癌发生发展中的作用。因此,我们通过本研究明确其在胃癌中的变化及机制。<br> 研究方法<br> 首先在公共数据库集中进行生物信息学分析,比较eIF4EBP3在胃癌组织和正常组织中的表达水平和启动子区甲基化状态,以及胃癌细胞株中eIF4EBP3的表达水平。RT-PCR、Westernblot验证胃癌细胞株中eIF4EBP3的表达。通过MSP和BGS检测eIF4EBP3的甲基化状态;免疫组化检测胃癌组织中eIF4EBP3的表达水平,并评估其蛋白表达与临床特征及预后的相关性。建立稳定转染的单克隆细胞株,进行体外细胞功能实验,探讨eIF4EBP3对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期等的影响,以及下游通路调控的分子机制。通过裸鼠皮下成瘤模型和胃癌肝转移模型实验来进一步验证eIF4EBP3在体内对胃癌增殖和肝转移的影响。质谱筛选eIF4EBP3的下游靶点,并且验证其相互关系及在胃癌发生发展中的作用。<br> 研究结果<br> eIF4EBP3在胃癌细胞系(6/7)和胃癌组织中(p<0.001)表达水平降低甚至沉默,而在这些表达降低或沉默由启动子DNA甲基化导致。151例胃癌临床标本中,eIF4EBP3在63例(41.7%)阴性表达,34例(22.5%)弱表达,癌旁正常组织中,22例(14.6%)阴性表达,41例(27.1%)弱表迖,二者有显著性差异(p<0.001)。eIF4EBP3表达与胃癌患者TNM分期(p=0.038)、病理学分级水平(p=0.009)显著相关。Kaplan-Meier生存曲线结果显示,eIF4EBP3高表达胃癌患者术后总体5年生存率显著高于低表达患者(p<0.001)。单因素COX回归分析发现,肿瘤TNM分期(Ⅲ和Ⅳ期)(p<0.001)和eIF4EBP3表达(p=0.003)均与患者生存预后相关。eIF4EBP3可以作为预测胃癌患者预后的生物学标记物。<br> 建立稳定转染eIF4EBP3的胃癌细胞株后,通过体内外试验发现,eIF4EBP3抑制胃癌细胞的增殖、传代、迁徙和转移,并将细胞阻滞在G1期;eIF4EBP3能够抑制胃癌细胞皮下成瘤能力和肝脏转移能力。LS-MS/MS筛选出下游目标基因β-catenin。IHC和WB证实二者表达存在负相关性。生物素RNApulldown实验证实eIF4EBP3通过抑制eIF4E介导的β-catenin的翻译下调β-catenin的蛋白水平,进而通过其下游效应分子如CDK1、Slug等抑制胃癌的增殖和迁移侵袭能力及肝脏转移。回补实验发现过表达β-catenin逆转了eIF4EBP3对胃癌细胞增殖和迁徙转移抑制。<br> 研究结论<br> 我们首次确认eIF4EBP3在胃癌中是一个抑癌基因,其在胃癌中表达沉默或降低。eIF4EBP3启动子甲基化是导致其沉默或降低的原因。eIF4EBP3通过抑制eIF4E介导的β-catenin的翻译下调β-catenin的蛋白水平,进而抑制胃癌的增殖和迁移侵袭能力及肝脏转移。eIF4EBP3表达水平可以用来判断原发性胃癌的生存预后。因此,我们提出eIF4EBP3可作为胃癌患者判断预后的新型肿瘤标志物。
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