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摘要在线粒体翻译的解码过程中，tRNAU34(摆动位置)的修饰对维持tRNA结构稳定、氨酰化功能、准确识别其同源密码子及确保蛋白准确翻译至关重要。U34修饰出现缺陷便会引起氧化磷酸化(OXPHOS)疾病，如MTO1或GTPBP3基因突变会影响mt-tRNAU34的τm5U(5-牛磺酸甲基尿嘧啶核苷)修饰，进一步导致肥厚型心肌病的发生；而TRMU基因突变则会影响mt-tRNAU34的s2U(2-硫尿嘧啶核苷)修饰，进而引发肝脏疾病。在前期研究工作中，本人所在研究团队还发现这3个参与U34修饰的核基因(MTO1，GTPBP3，TRMU)可以调控mt-DNA12SrRNAA1555G突变造成的耳聋表型。目前，人们对tRNA修饰基因突变导致疾病的分子基础以及不同修饰基因的突变导致不同的临床症状的原因还知之甚少。因此，本课题利用斑马鱼模型分别对trmu和mto1基因缺陷导致疾病的致病机制进行了深入探索。<br>　　TRMU(又称MTU1)是一种高度保守的线粒体tRNA修饰酶，在脊椎动物中主要负责对三种mt-tRNAU34进行s2U修饰。但是TRMU缺失对线粒体突变导致的耳聋表型的影响以及其致病机理仍然不是十分清楚。我们使用CRISPR/Cas9系统构建了trmu基因敲除的斑马鱼模型。在trmu敲除的纯合突变体中，发现3种mt-tRNA(tRNALys，tRNAGlu，tRNAGln)U34s2U修饰完全缺失。修饰的缺失会影响到mt-tRNA的代谢水平，导致所有mt-tRNA稳态水平下降，最终影响到线粒体翻译水平，呼吸链酶活和线粒体ATP的产生。在trmu纯合敲除的斑马鱼组织，如肌肉，脑和眼睛等均未表现出明显变化，但是听力感觉器官包括耳石和侧线系统都出现了明显异常，如耳石变小，侧线系统神经丘数量减少。另外，trmu纯合敲除斑马鱼会表现出异常游泳行为和惊吓反应。因此我们得出结论：Trmu缺失导致mt-tRNAs2U修饰缺失，引起mt-tRNA稳态下降，翻译受损，进而造成线粒体呼吸链功能，导致听觉器官发生异常。该发现也许是一种新的耳聋致病机理，并为前期研究中提出的TRMU基因突变导致线粒体呼吸缺陷的假设和实验现象提供了直接的实验证据。<br>　　MTO1蛋白是核基因编码定位于线粒体的蛋白，进化上高度保守，在脊椎动物中主要负责对五种mt-tRNAU34进行τm5U修饰。但MTO1基因点突变导致肥厚型心肌病的致病机制目前仍不明确，而且缺少研究该疾病的动物模型。因此我们使用CRISPR/Cas9技术构建了稳定可传代的mto1基因敲除斑马鱼模型。该模型可重塑人类MTO1基因突变导致的心肌肥厚表型，如斑马鱼胚胎心脏发育缓慢，心肌细胞肥大。另外，我们发现mt-tRNAU34s2U与τm5U修饰是独立的，mto1缺失未影响到trmu的功能。同时还发现mto1缺失不影响线粒体tRNA稳态水平，但影响mt-tRNAGln，mt-tRNAGlu，mt-tRNALys，mt-tRNATrp，mt-tRNALeu(UUR)的空间结构和氨酰化程度，进而损伤线粒体呼吸复合物蛋白亚基的表达水平，相关复合物的酶活以及线粒体ATP的产生。因此线粒体呼吸氧化功能发生障碍也许是导致心脏疾病发生的主要原因。