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摘要乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌按照基因分子分型可分为管腔上皮a型，管腔上皮b型，表皮生长因子受体2(HER2)过表达型以及基底样亚型(basal-like breast cancer, BLBC )。其中基底样亚型乳腺癌患者占10-20%，易发生于年轻女性，通常具有转移能力强、复发率高、对化疗不敏感、易发生脑转移和肺转移等特征，这导致了患者极低的生存率。因此，深入研究基底样乳腺癌的分子机制和发病机理，有助于我们寻找相关的特异性靶点以利于早期诊断与预防。<br>　　γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。在神经细胞中，GABA通过和细胞表面的受体结合，导致细胞内钙离子浓度上升，从而发挥它的生物学功能。除了作为神经递质外，有研究表明GABA和肿瘤的发生发展密切相关，在结肠癌，胃癌和肝癌中GABA对肿瘤的生长和转移有抑制作用；而在胰腺癌中，GABA能够通过促进它的受体表达上调，从而促进肿瘤细胞的增殖。这些发现表明GABA能系统在不同肿瘤的发生发展中的重要作用。<br>　　我们在临床样本数据库中发现在基底样乳腺癌中，γ-氨基丁酸转氨酶(gamma-aminobutyrate aminotransferase, ABAT)的表达量较其他亚型显著降低。ABAT是GABA代谢的一个关键酶，它能够催化GABA降解生成琥珀酸半醛和L-谷氨酸，从而有助于GABA水平的降低。通过对乳腺癌代谢物组学数据库分析，我们发现ABAT表达量低的肿瘤组织中GABA的含量较高。<br>　　我们在研究ABAT和BLBC之间的关系时发现ABAT在不同亚型乳腺癌样本中基因组拷贝数存在变化，且在临床数据库中ABAT和Snail的表达呈负相关。Snail是第一个被证实的EMT诱导因子。在胚胎形成和转移期间，Snail是调控EMT的锌指结构的转录抑制因子，其基因序列从低等无脊椎动物到脊椎动物乃至人类均高度保守，尤其是它的DNA结合域。Snail的表达和肿瘤的等级以及肿瘤的淋巴结转移相关，其高表达肿瘤患者预后较差。Snail作为EMT的关键性诱导因子，有助于靶基因的转录，在肿瘤细胞增殖分化、侵袭和转移过程中均起到关键的作用。我们通过转录因子预测软件分析，发现在ABAT的启动子上含有4个保守的Snail结合位点E-box(CAGGTG)。<br>　　综合以上，我们推测由于ABAT在基因组上拷贝数的变化以及Snail的抑制作用，使ABAT在基底样乳腺癌中的表达量降低，导致其代谢底物GABA的增加并通过GABA激活相关信号通路，从而促进乳腺癌的发生发展。基于以上推测我们设计实验得出以下结论:<br>　　1.ABAT在基底样乳腺癌中低表达，并促进细胞成瘤和转移能力<br>　　通过对多个乳腺癌细胞系及临床样本基因表达数据库进行分析，我们发现在基底样亚型乳腺癌细胞系或肿瘤样本中ABAT的表达量均显著降低。我们提取30例乳腺癌患者新鲜的肿瘤组织全蛋白，用westernblotting实验验证了以上分析结果；我们分别选取5株管腔型和5株基底样亚型乳腺癌细胞株，通过westernblotting,RT-PCR和荧光定量PCR验证了上述分析结果。<br>　　此外，临床样本数据分析显示:ABAT表达低的患者具有肿瘤体积大、组织学分级高、转移能力强、对化疗不敏感及生存率差等特征。我们在基底样乳腺癌细胞系MDA-MB231和SUM159上转染表达ABAT和相应的空载质粒，体外和体内实验都表明ABAT表达能够显著抑制细胞的成瘤和转移能力。<br>　　以上结果证实ABAT在基底底样乳腺癌中低表达，并促进肿瘤的成瘤和转移能力。<br>　　2.ABAT在基底样乳腺癌基因组上的拷贝数减少；ABAT是Snail的靶基因<br>　　通过对乳腺癌临床样本数据库分析，我们发现有5%左右的患者在基因组上存在ABAT拷贝数减少，其中基底样乳腺癌占了70%左右；我们也对乳腺癌细胞系基因组数据库进行了分析，结果显示30%左右的细胞系中存在ABAT拷贝数的减少，其中基底样乳腺癌细胞系占了85%。这说明基底样乳腺癌中ABAT低表达的部分原因是由于ABAT基因拷贝数的减少导致的。<br>　　在管腔型乳腺癌细胞BT483、HCC1428和MCF7中表达Snail,westernblotting和荧光定量PCR显示ABAT的表达量在mRNA和蛋白水平都下降；双荧光素酶报告基因实验表明离ABAT转录起始位点最近的一个E-box起到关键的抑制作用；ChIP实验的结果表明Snail能够结合到ABAT的启动子上。以上结果证实，ABAT是Snail的靶基因。<br>　　3.ABAT表达降低激活钙离子-NFAT1通路<br>　　在基底样乳腺癌细胞系MDA-MB231，SUM159和BT549中转染表达ABAT或相应的空载质粒，我们发现ABAT表达使细胞中GABA含量有明显的降低。随后我们通过钙离子荧光实验发现:ABAT表达能够显著减少细胞内钙离子浓度；在基底样乳腺癌细胞中钙离子浓度显著高于管腔型细胞。我们通过钙离子荧光证实GABA主要通过激活GABA-A受体使细胞内钙离子浓度提升。在肿瘤细胞中，钙信号能够激活或抑制相关的癌基因或者抑癌基因的表达。有研究表明NFAT1在三阴性乳腺癌中激活能够促进肿瘤的增殖和转移；NFAT对钙离子浓度变化极其敏感，钙离子浓度的升高能够使它去磷酸化变为激活形式，从而进入细胞核激活相关基因的表达。我们对表达ABAT的细胞株内同时表达NFAT1。通过对MDA-MB231和SUM159细胞进行免疫荧光和核质分离westernblotting实验。结果显示ABAT表达能够显著降低NFAT1在细胞核内的定位从而抑制肿瘤的发生发展。<br>　　综合以上，我们得出以下结论:<br>　　1.ABAT在基底样乳腺癌中异常低表达。ABAT的表达高低与乳腺癌患者的预后密切相关，其低表达的乳腺癌患者预后较差。<br>　　2.ABAT在部分基底样乳腺癌患者的肿瘤组织中基因拷贝数减少；ABAT是Snail的靶基因。由于以上两个原因，ABAT在基底样乳腺癌中的表达水平都显著低于其他亚型。<br>　　3.ABAT低表达介导的GABA提升通过激活GABA-A受体调高细胞钙离子浓度，从而激活NFAT1促进肿瘤发生发展。