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摘要第一部分：MAML3通过调控ZEB1诱导免疫抵抗型肝癌细胞上皮间质转化<br>　　背景肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)的发病率以及死亡率均位居世界前列，是最常见的肝脏肿瘤之一，由于肝癌的易复发和转移肝癌的治疗效果不理想，其预后往往不佳。肝NK细胞在肝脏的免疫监视中起着重要作用，NK细胞的耗竭和功能障碍与HCC的发生发展密切相关。并且，随着肝癌的发生发展，逐渐对NK细胞产生免疫抵抗性，从而发生免疫逃逸，更易发生复发转移。大量的研究结果已知，在肝癌发生和发展中，上皮间质转化(EMT)发挥了极其重要的作用。<br>　　MAML3(mastermind-like 3)是Notch信号传导中的转录调节因子，在细胞发育、增殖和分化等过程中起到重要的作用。有少量研究证实MAML3在癌症细胞的侵袭和转移过程中有重要作用。然而MAML3在肝癌中是否起作用，目前尚未可知。<br>　　已有很多研究发现ZEB1作为EMT中最为关键的分子之一，能够抑制E-cadheirn蛋白，从而在多种肿瘤中促进EMT发展。<br>　　目的本篇研究旨在通过构建经NK细胞长期诱导的免疫抵抗性肝癌细胞(HCC-R)，通过分子生物学的基础研究，阐明MAML3在HCC-R的表达情况及其在肝癌转移和侵袭中的机制，为肝癌免疫抵抗后的治疗提供新的思路。<br>　　方法我们通过将肝癌细胞与NK细胞长期共培养，诱导产生具有免疫抵抗性的肝癌细胞(HCC-R)，并利用乳酸脱氢酶细胞毒性实验(LDH cytotoxicity assay)验证了HCC-R对NK细胞的耐受性。同时，我们通过CCK-8、Transwell细胞迁移和侵袭实验研究HCC-R在增殖、迁移和侵袭方面的变化。利用qPCR、WesternBlot发现HCC-R中的MAML3表达量明显增加，且与EMT标志物E-cadherin有一定关系。最后，我们通过检测敲减MAML3后检测细胞的EMT标志物探究MAML3对HCC-R侵袭转移的影响。<br>　　结果我们成功构建了2株免疫抵抗型肝细胞肝癌细胞株，并发现其有更强的转移侵袭能力，并且在敲减MAML3后，这2株免疫抵抗型肝癌细胞株的转移和侵袭能力均明显减弱。<br>　　结论我们第一次在体外构建了对NK细胞杀伤耐受的免疫抵抗型肝癌细胞株，并发现在免疫抵抗型肝癌细胞中，MAML3可以增强其转移及侵袭的能力。MAML3通过促进ZEB1的表达来抑制E-cadherin，从而导致肝癌的侵袭和转移能力增强。因此，MAML3非常具有成为肝癌治疗的新靶点的潜力。<br>　　第二部分：MoO2-R837纳米颗粒在肿瘤协同治疗中的应用<br>　　背景肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一，在全世界癌症导致的死亡率中占据第二位，手术切除病灶为目前肝癌的主要治疗手段。由于肝癌发病的隐匿性，部分患者在确诊时已进展至中晚期，常伴有“扩散、转移和免疫抵抗”，手术治疗的效果往往不佳。即便是已行手术治疗的肝癌患者，癌症的复发和转移仍成为其死亡的主要原因。<br>　　近年来，免疫治疗因其疗效显著，迅速发展成为继手术、放化疗后的新型治疗手段之一，尤其是针对转移瘤，治疗效果独特。免疫检查点阻断治疗在临床癌症治疗中逐渐显现出它的价值。光热疗法(Photothermal therapy，PTT)可通过外部激光在局部产生高温从而实现肿瘤杀伤作用，避免全身毒性，副作用小，实现局部精准治疗。同时PTT可激活机体免疫反应，联合免疫检查点阻断治疗可提高疗效。<br>　　纳米技术与新型材料融合，诞生的各种类型的纳米药物载体构建了多功能协同光治疗平台，给包括肝癌在内的癌症的诊治带来了一场全新的变革。<br>　　目的本研究提出构建多功能纳米载药体系，在PTT杀伤肿瘤的同时调控肿瘤免疫环境，与免疫检查点阻断治疗联合，不同治疗方法之间的协同得以实现，从而有效发挥免疫抗肿瘤效应。<br>　　方法我们首先制备了MoO2-R837纳米材料，利用场发射扫描电子显微镜(FESEM，Hitachi SU-70)和透射电子显微镜(TEM，Tecnai F20，FEI )研究了材料的微观结构特征。用X射线衍射(XRD，X‘pert pro MPD )对纳米材料结构进行了表征。同时，我们构建了免疫抵抗型小鼠肝脏肿瘤细胞(Hep1-6 R)，模拟具有免疫抵抗性的肝癌。通过CCK8细胞增殖试验验证了MoO2-R837对正常细胞293T、肿瘤细胞Hep1-6wt、Hep1-6R都没有毒性，满足进行后续治疗实验的条件。通过体外实验证实近红外(NIR )触发的PTT具有良好的肿瘤细胞杀伤效果，并且通过小鼠肝癌原位成瘤模型构建技术以及双侧皮下肿瘤人工模型的建立研究了PTT与免疫检查点阻断联合治疗应用对转移瘤的治疗是否有贡献。<br>　　结果在良好的体外实验结果基础上，我们采用了小鼠肝癌细胞Hep1-6wt、Hep1-6R在C57BL/6小鼠上构建肝脏原位成瘤模型及双侧皮下肿瘤模型进行一系列实验。研究发现，所有小鼠的体重都保持在相同的水平，表明MoO2-R837纳米材料在体内不会产生明显的毒性反应。在PTT治疗后，使用MoO2-R837纳米材料的肿瘤体体积迅速缩小，而联合PD-L1免疫检查点阻断治疗的转移瘤体体积亦缩小，且治疗后2周内没有复发现象。<br>　　结论我们发现MoO2纳米颗粒具有高效率的光热效应，可在808nm的近红外光照射下，通过光热疗法(PTT )直接杀死小鼠肝癌细胞(Hep1-6 wt)甚至恶性程度更高的Hep1-6R细胞。其过程中产生肿瘤相关抗原，在免疫佐剂咪喹莫特(R837)的帮助下，可激发强烈的全身抗肿瘤免疫反应，可促进PD-L1免疫检查点阻断治疗，并且该协同疗法对小鼠体内残留的未受照射的远距离肿瘤具有明显的杀伤和抑制作用。