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摘要背景<br>　　脯氨酸4-羟化酶β亚基(Prolyl 4 - hydroxylase beta polypeptide，P4HB)是重要的内质网分子伴侣蛋白，P4HB可抑制错误折叠蛋白的积聚，抑制内质网应激强度加剧，从而抑制肿瘤细胞凋亡，保护在内质网应激状态下的肿瘤细胞生存。但P4HB在肝癌中的表达及其在肿瘤发生发展过程中的作用机制目前尚不清楚。<br>　　目的<br>　　研究P4HB在肝癌细胞及组织中的表达水平，验证P4HB其对肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响；探索P4HB对肝癌细胞发生发展作用的分子机制。方法<br>　　1.采用RT-PCR及WesternBlot方法检测5个人肝癌细胞系(Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B and SK-Hep-1)和正常肝细胞(LO2)中P4HB基因及蛋白表达水平。采用RT-PCR及WesternBlot方法检测12组肝癌组织和相邻正常肝组织中的P4HB基因及蛋白表达水平。Kaplan-Meier分析P4HB蛋白表达水平与肝癌患者临床预后的关系。<br>　　2.选用P4HB高表达HepG2、Huh-7两个人肝癌细胞系，通过采用WesternBlot方法分别检测P4HBsiRNA组、P4HB质粒组及其对照组中的P4HB蛋白表达水平。通过MTT法及Transwell法分别验证干扰及过表达P4HB对肝癌细胞(HepG2、Huh7)增殖及迁移、侵袭能力影响。<br>　　3.采用WesternBlot方法检测人肝癌细胞系(HepG2、Huh-7)中P4HBsiRNA组、P4HB质粒组及其对照组中EMT关键蛋白(E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin)表达水平。验证P4HB是否诱导HCC细胞的EMT。<br>　　4.采用RT-PCR及WesternBlot方法检测GRP78在肝癌组织中的基因及蛋白表达水平，验证GRP78mRNA水平与P4HB表达之间相关性。<br>　　5.构建P4HB、GRP78稳定表达与稳定干扰的慢病毒载体，分别进行干扰及过表达两大组实验，干扰实验分四小组：单独P4HBsiRNA组、单独GRP78siRNA组、P4HBsiRNA及GRP78siRNA组和对照组；过表达四小组：单独P4HB质粒组、单独GRP78质粒组、P4HB质粒及GRP78质粒组和对照组。利用Western-blot检测调控P4HB、GRP78各组EMT关键蛋白(E-cadherin、N-cadherin、vimentin)表达量变化。验证假设HCC细胞中P4HB的致癌性质可能是由GRP78通过介导EMT进行。MTT法检测各组肝癌细胞的增殖活性；Transwell检测各组肝癌细胞迁移及侵袭能力。<br>　　6.构建裸鼠肝癌模型。稳定转染P4HB慢病毒干扰载体HepG2肝癌细胞株移植后，观察肿瘤生长情况，肿瘤体积及质量。<br>　　结果<br>　　1.RT-PCR及WesternBlot检测结果显示：5个肝癌细胞系较正常肝细胞中P4HBmRNA及蛋白水平均高表达，且差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。较正常癌旁组织，肝癌组织中P4HB的mRNA表达水平显著上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。Kaplan-Meier分析显示HCC患者生存率与肿瘤P4HB表达水平之间呈显著负相关(P=0.0003)。<br>　　2.P4HB质粒及P4HBsiRNA转染HepG2、Huh-7两个肝癌细胞系后，WesternBlot检测结果显示P4HBsiRNA组P4HB蛋白表达水平较ControlsiRNA后显著减低，差异有统计学意义，P＜0.05；P4HB质粒组与其对照组相比，P4HB蛋白表达水平增高，差异具有统计学意义，P＜0.05。MTT检测结果示：两个肝癌细胞系(72h)的细胞活性，P4HBsiRNA组较其对照组均减低(HepG2：2.12±0.25vs3.51±0.30，P＜0.05；Huh7：3.43±0.15vs2.20±0.25，P＜0.05)；P4HB质粒组较其对照组细胞增殖速度增高，(HepG：5.52±0.25vs3.48±0.15，P＜0.05；Huh7：4.59±0.25vs3.45±0.32，P＜0.05)，差异有统计学意义。Transwell检测结果显示P4HBsiRNA肝癌细胞的迁移及侵袭能力减低；而P4HB质粒细胞迁移、侵袭能力增加，与对照组相比差异均有统计学意义。<br>　　3.WesternBlot检测P4HBsiRNA组中EMT关键蛋白表达水平，与空载体转染组相比，干扰P4HB后，上皮表型E-钙粘素(E-cadherin)表达上升，间质表型波形蛋白(vimentin)、N-钙黏素(N-cadherin)表达下降。而P4HB质粒组出现相反的结果，即E-cadherin表达下降，vimentin、N-cadherin表达上升。免疫荧光检测EMT标记蛋白表达验证了WB检测结果。<br>　　4.应用WesternBlot检测转染后P4HB的细胞中GRP78的表达，结果示，干扰P4HB表达后，肝癌细胞中GRP78蛋白表达水平及mRNA水平较空载转染组均显著上调，而转染过表达P4HB质粒后肝癌细胞中GRP78蛋白表达水平及mRNA水平较转染空质粒后显著下调。<br>　　5.应用WesternBlot检测GRP78表达对细胞上皮间质角化EMT的影响，结果所示，与空载转染组相比较干扰GRP78后，促进上皮间质角化。而过表达GRP78后，出现相反结果。而GRP78表达对细胞EMT的影响可以通过调控P4HB逆转。<br>　　6.Transwell检测结果显示干扰肝癌细胞中GRP78表达，可促进癌细胞迁移、侵袭能力，而过表达GRP78后，肝癌细胞的迁移、侵袭能力显著降低。而GRP78表达对癌细胞迁移、侵袭能力的影响同样可以通过调控P4HB逆转。<br>　　7.稳定转染P4HB慢病毒干扰载体HepG2肝癌细胞株移植后37天，瘤体体积及质量均较对照组相比明显缩小。<br>　　结论<br>　　1.P4HB在肝癌细胞和组织高表达。<br>　　2.P4HB促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。P4HB促进肝癌细胞EMT转化，提示P4HB可能通过促进肿瘤EMT转化发挥恶性作用。<br>　　3.P4HB负调控肝癌细胞中GRP78的表达。GRP78能降低EMT转化抑制肝癌细胞迁移、侵袭能力，但可以通过调控P4HB逆转。提示HCC中P4HB可能通过干扰GRP78/EMT影响细胞的增殖、迁移及侵袭能力而促进其致癌作用。<br>　　4.动物实验验证得出干扰P4HB表达能抑制裸鼠体内移植瘤的生长。<br>　　P4HB通过调控GRP78信号通路影响EMT过程促进HCC的发生发展，为临床肝癌治疗及疗效预测提供实验基础。