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摘要血友病B是一种由于人凝血因子IX(hFIX)缺乏引起的严重遗传性出血疾病，其治疗方法主要是给病患补充hFIX。过去，hFIX是从血浆中分离的，但是制备成本高昂且易传播疾病，因而该药物已逐渐被重组hFIX所替代。<br>　　为了高效分离纯化重组hFIX用于血友病B治疗，本论文从双峰驼非免疫抗体库中筛选到了特异性结合hFIX的单域抗体，并将其与抗体Fc融合，构建哺乳动物细胞的高效表达(和后续纯化)的细胞株，获得了针对hFIX的重组抗体，它们可以用作专一结合hFIX的亲和配体，将应用于后续重组hFIX的生产。<br>　　本文首先以重组hFIX为筛选靶标，对双峰驼非免疫单域抗体的噬菌体展示库进行了亲和筛选。经过3轮淘洗，噬菌体的回收率显著上升，说明结合hFIX的噬菌体克隆得到了有效富集。随后，以富集得到的噬菌体感染大肠杆菌TG1，随机挑取单克隆诱导单域抗体表达，并通过ELISA检测其与hFIX的结合情况。其次，对ELISA阳性克隆进行DNA测序，得到多个候选单域抗体克隆。再次，通过PCR扩增这些候选单域抗体的VHH编码序列并与抗体Fc编码序列融合，构建质粒并转染至哺乳动物细胞293F中表达重组抗体。最后，通过SDS-PAGE对培养液上清进行检测，发现重组抗体均有较高的表达量，继而用蛋白A亲和层析进行一步法纯化，制备了多个抗hFIX的重组抗体。<br>　　在此基础上，本文对这些重组抗体进行了功能验证：ELISA和Octet检测发现这些重组抗体均能与hFIX结合，从结合曲线计算出它们与hFIX结合的解离常数(KD)均在nmol/L级水平，表明构建的重组抗体与hFIX有很好的结合活性；流式细胞检测重组抗体与空白CHO-K1细胞和293F细胞的非特异结合力，结果显示测试组的平均荧光强度与空白对照或阴性对照没有显著性差异，因此不存在重组抗体与空白细胞非特异的结合；SEC和ELISA检测发现酸碱处理不影响重组抗体的纯度及抗原结合活性，表明这些重组抗体具有较好的稳定性；ELISA检测还发现重组抗体65-Fc只能与hFIX结合，而其它重组抗体既能与hFIX结合又能与hFVII结合，但未检测到与其它蛋白结合；Westernblot检测发现重组抗体52-Fc、64-Fc和69-Fc也能与变性的hFIX和hFVII结合，而69-Fc与活性和羧基化好的hFIX结合更好。<br>　　综上，本文利用噬菌体展示技术筛选出了具有对hFIX亲和结合活性的单域抗体，基因测序后将其与Fc序列融合，构建重组抗体特异表达的293细胞株，重组抗体表达后以蛋白A亲和层析一步法纯化，获得高纯度的重组抗体，经功能验证，有多组重组抗体对hFIX的结合活性强、稳定性好，特异性强，可用于制备纯化重组hFIX的亲和配体，也可用于制备乏hFIX血浆。