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摘要果蝇(Drosophila melanogaster)先天免疫主要包括Toll和Imd两条信号通路，它们分别与哺乳动物的TLR(Toll-like Receptor)和TNFR(Tumor Necrosis Factor Receptor)通路高度相似。因此，果蝇是研究人类先天免疫的重要模式生物，它为研究昆虫与人类先天免疫之间的关系架起了桥梁。系统地开展果蝇先天免疫响应的机制研究，不仅有助于揭示果蝇免疫稳态的维持机制，而且对哺乳动物免疫调控机制的深入研究也具有非常重要的科学意义。<br>　　果蝇的先天免疫是抵抗外来病原微生物入侵的第一道防线。然而，免疫响应的过度激活或不足都会对机体造成不同程度的损伤。因此，为了避免免疫稳态的失衡，果蝇主要是通过精确地激活和有效地抑制Toll或Imd信号通路中的关键因子的表达来实现。当前，除了发现各种激活子和抑制子等参与免疫响应调控外，还发现microRNA(miRNA)可以通过靶向免疫信号通路中的基因参与果蝇的免疫响应，但在免疫响应过程中参与免疫调控的miRNA自身表达是如何被调控的？至今仍不清晰，还需进一步深入研究。<br>　　众所周知，Myc是生物体中极其重要的转录因子，在多种基本的细胞活动过程中起着至关重要的作用，包括细胞周期、细胞生长、增殖、凋亡等细胞过程。然而，果蝇Myc(Drosophila Myc, dMyc)是否与果蝇的先天免疫反应有关，dMyc是否可以通过调控某个或某几个miRNA的表达进而参与果蝇先天免疫响应？为此，本论文围绕以上几个重要的科学问题开展了一系列的研究，具体内容如下：<br>　　1.为确定dMyc在果蝇Imd免疫通路中的功能，利用Gal80ts-tub-Gal4系统构建多种dMyc突变果蝇品系：dMyc高表达果蝇品系、dMyc敲低型果蝇品系以及dMyc和dMyc-RNAi共高表达果蝇品系。在感染大肠杆菌E.coli后，分别检测果蝇Imd通路下游标志性抗菌肽Diptericin的表达。实验结果表明高表达dMyc可以下调Diptericin的表达，暗示其可能是负调控果蝇Imd通路的免疫响应。<br>　　2.借助多种生物信息学分析手段获得dMyc潜在调控的果蝇Imd通路免疫相关miRNAs。利用依据Targetscan和miRanda预测结果的交集获得了可能靶向63个果蝇Imd通路相关基因的miRNA；进一步利用PROMO网站和TransmiR2.0数据库得到dMyc潜在调控的miRNA，再并与本实验室之前的smallRNA-seq获得的差异表达miRNA(DEmiRNA)取交集，结果发现dMyc能够调控12个miRNA(miR-10、miR-1012、miR-184、miR-275、miR-276a、miR-277、miR-278、miR-279、miR-2b-2、miR-965、miR-996和miR-998)靶向果蝇Imd通路免疫相关的基因。<br>　　3.通过高表达miRNA免疫相关筛选，以及dMyc和miRNA之间的表达正相关性筛选，发现只有dMyc调控的miR-277能够参与果蝇Imd通路免疫响应。进一步采用双荧光素酶报告系统实验分析miR-277基因的启动子活性，染色质免疫共沉淀-qPCR实验技术证实dMyc可以通过与miR-277启动子区直接结合激活miR-277的转录。<br>　　4.通过生物信息学分析发现miR-277的潜在靶基因编码Imd通路中两个关键信号因子imd和Tab2。果蝇S2细胞中双荧光素酶报告实验进一步表明：miR-277可以直接靶向imd和Tab2-Ra/b的3’UTR，而不是靶向Tab2-Rc的3’UTR。研究结果揭示miR-277通过抑制imd和Tab2-Ra/b的表达进而负调控果蝇Imd通路免疫响应的分子机制。<br>　　5.构建了dMyc和miR-277sponge(miR-277 SP)共高表达果蝇品系，在果蝇体内对dMyc和miR-277在Imd信号通路免疫响应中的作用进行研究。结果发现在dMyc和miR-277sponge共高表达果蝇中miR-277水平恢复至正常水平的背景下，抗菌肽Diptericin、靶基因imd和Tab2均得到一定的恢复。这表明dMyc确实能通过激活miR-277转录实现对关键免疫信号因子imd和Tab2的抑制，进而抑制抗菌肽Diptericin的表达，从而负调控果蝇Imd信号通路的免疫响应。<br>　　6.通过对野生型果蝇感染大肠杆菌后Diptericin、dmyc、miR-277及靶基因imd和Tab2随时间的动态表达模式研究，发现dMyc在免疫响应的中后期阶段发挥其负调控功能，表明为避免果蝇的免疫过度对自身的伤害，dMyc的负调控在果蝇免疫稳态的恢复中起重要的作用。此外，进一步对革兰氏阴性致死菌E.cloacae感染的dMyc高表达果蝇生存进行分析，发现dMyc的高表达提高了果蝇的生存能力。<br>　　本论文的研究结果表明，dMyc在维持果蝇Imd免疫稳态中发挥着至关重要的作用。一方面，在大肠杆菌感染的早期阶段，下调的dMyc可以进一步下调miR-277表达，进而上调靶基因imd和Tab2的表达；同时上调imd和Tab2促进抗菌肽Dpt的表达继而有效抵抗病原微生物的入侵。另一方面，在大肠杆菌感染的中后阶段，为了防止Imd免疫响应的过度激活，抗菌肽Dpt的过度表达会诱导dMyc的上调表达，进而增加miR-277的表达，而上调的miR-277会进一步下调imd和Tab2的表达继而抑制Dpt的表达。总之，本论文的研究结果揭示了转录因子dMyc在果蝇的先天免疫响应中起着重要的调控作用，是防止免疫反应过度激活的关键调控因子。本文的研究结果不仅阐明了dMyc和miR-277的新功能和调控模式，而且也为深刻揭示果蝇先天免疫稳态维持的复杂调控机制提供了新的见解和思路。