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摘要目的：食管癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，中国是食管癌的高发区，放疗是食管癌标准治疗方法之一，但放射抗性始终是限制放疗疗效提升的重要瓶颈。我们前期研究发现NRAGE可能通过Wnt/β-catenin信号通路参与食管鳞癌放射抗性的形成。但这些研究都是建立在2D平面培养，无法真实模拟人体内肿瘤生长的微环境。3D细胞培养是一种模拟体内组织细胞立体生长的体外细胞培养技术，然而目前对于应用3D生物打印技术构建食管癌细胞模型的研究尚无报道。本研究借助3D细胞打印技术，以明胶、海藻酸钠和食管癌细胞混合物为打印材料，构建了可模拟体内肿瘤微环境的3D食管癌细胞模型，并与2D平面培养细胞模型比较，检测两种模式下，食管癌细胞增殖的情况。在两种培养模式下，研究过表达NRAGE对食管癌细胞增殖和放射抗性的作用。<br>　　方法：<br>　　1.利用3D细胞打印技术，将人食管癌细胞/明胶/海藻酸钠构建3D食管癌细胞模型。<br>　　2.采用钙黄绿素-AM和碘化丙啶溶液对3D食管癌细胞模型进行活/死细胞双荧光染色，评价打印后细胞的存活率。<br>　　3.显微镜下观察打印后1，7，14天的模型结构，并通过HE染色观察打印后7，14，21天3D食管癌细胞模型的细胞形态。<br>　　4.扫描电镜观察打印后7，14天的3D细胞模型的生长状态。<br>　　5.用AlamarBlue法检测食管癌细胞在2D培养和3D细胞模型中的增殖差异以及过表达NRAGE对不同水平培养的食管癌细胞增殖的影响。<br>　　6.用上述方法分别建立Eca109和Eca109/NRAGE食管癌细胞3D模型，给予0Gy和10Gy照射，继续分组培养，至7，14，21天，免疫组化检测两种细胞ki-67、β-catenin、NRAGE的表达状况。<br>　　7.AlamarBlue法检测2D平面培养和3D细胞模型中Eca109和Eca109/NRAGE食管癌细胞在接受10Gy照射前后增殖情况，并比较两者的差异。<br>　　结果：<br>　　1.成功构建3D食管癌细胞模型，打印参数：气压0.3MPa,速度6mm/s,喷嘴0.26mm,喷头温度18℃，平台温度6℃，打印模型呈立方体外形，内部结构为网格状,尺寸为8×8×1.4mm3，层厚0.28mm，层高5层。<br>　　2.3D细胞模型中Eca109细胞组和Eca109/NRAGE细胞组的细胞存活率分别为0.7881±0.02306，0.8354±0.007338；P=0.0476。<br>　　3.构建的3D食管癌细胞模型，显微镜下观察与HE均显示打印的细胞分布均匀，且在第7天呈球形团块状生长，相对于亲本细胞Eca109，过表达NRAGE的Eca109/NRAGE细胞有明显的成团增长趋势。培养至14天和21天时，细胞团块继续增殖变大并形成简单的立体结构。在培养期间，天然明胶逐渐降解为肿瘤细胞的成团生长提供了空间。<br>　　4.扫描电镜显示，3D食管癌细胞支架培养第7天，两种细胞3D支架表面有凸起的圆形细胞球；培养第14天时，可见支架边缘细胞球表面有分泌物形成，且Eca109/NRAGE组较Eca109组细胞球表面分泌物多。<br>　　5.AlamarBlue结果显示，2D培养环境下，Eca109和Eca109/NRAGE细胞,在培养的第一周内增殖速度快，一周后呈下降趋势；而3D细胞培养环境下，两种细胞初期增殖缓慢，随培养时间延长增殖速度加快呈上升趋势。Eca109/NRAGE食管癌细胞在两种培养环境中，均比Eca109细胞增殖速度快。<br>　　6.免疫组化结果显示，与亲本Eca109细胞3D模型相比，照射组和非照射组培养至第7，14，21天，过表达NRAGE的3D细胞模型ki-67、β-catenin、NRAGE表达均增高。<br>　　7.AlamarBlue结果显示，无论2D细胞培养模型还是3D肿瘤细胞模型中，过表达NRAGE食管癌细胞在接受10Gy照射前后，均比亲本Eca109细胞增殖速度快。2D培养环境下，两种细胞在10Gy照射后的第7天增殖速度下降至最低点；而在3D细胞培养环境下，两种细胞在10Gy照射后的第11天增殖速度开始减慢，并且和非照射组比呈下降趋势。<br>　　结论：<br>　　1.通过3D生物打印技术以明胶和海藻酸钠为材料，可以建立3D食管癌细胞模型。<br>　　2.与2D模型相比，3D培养的食管癌细胞形态已初具组织学特征，增殖规律可能更接近体内实际状态，提示3D模型在研究中的优势。<br>　　3.3D食管癌细胞模型中，过表达NRAGE食管癌细胞较亲本Eca109细胞活力、增殖能力、ki-67、β-catenin、NRAGE表达、放射抗性均增强，同2D培养状态下的结果一致，进一步证实NRAGE通过Wnt/β-catenin通路影响食管癌细胞放射抗性的客观性。