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摘要目的：<br>　　MNAT1(menage a trois 1, MANT1)作为细胞周期依赖激酶的激酶复合物(CAK)第三个亚基，在多种肿瘤中异常高表达，且与肿瘤的发生发展密切相关，然而MNAT1作用的分子机制不明确。为探索MNAT1参与肿瘤发生发展的分子机制，本研究以结直肠肿瘤为实验对象，阐明MNAT1在结直肠癌发生发展中的作用和分子机制。<br>　　方法：<br>　　1.采用免疫组化方法对含80例不同临床分期的结直肠癌与癌旁组织及另外20例结直肠癌组织芯片进行分析，检测组织芯片中MNAT1蛋白表达水平，并分析MNAT1表达与结直肠癌临床病理特征的关系，评价MNAT1在结直肠癌诊断和预后判断价值。<br>　　2.采用基因转染技术构建HCT116和DLD1结直肠癌细胞MNAT1过表达稳定细胞株，采用MTT和细胞克隆形成实验检测MNAT1过表达对HCT116和DLD1细胞增殖和克隆形成的影响。采用shRNA(short hairpin RNA)技术构建HCT116和DLD1结直肠癌细胞MNAT1敲低稳定细胞株，采用Transwell迁移和侵袭实验检测MNAT1敲低对HCT116和DLD1细胞迁移和侵袭的影响。<br>　　3.采用Western-blotting和Real-timePCR，分别检测MNAT1过表达HCT116和DLD1细胞中MNAT1和p53的蛋白及mRNA表达。<br>　　4.用蛋白酶体抑制剂MG132处理MNAT1过表达HCT116细胞，采用Western-blotting检测MNAT1和p53蛋白表达。采用免疫共沉淀实验(co-Immunoprecipitation, Co-IP)分析MNAT1过表达细胞株和敲低表达稳定细胞株p53泛素化表达水平；在MNAT1过表达和敲低表达稳定细胞中转染HA-Ub、Flag-p53或V5-MNAT1，Western-blotting检测泛素化p53表达。<br>　　5.采用放线菌酮(Cycloheximide, CHX)分别处理HCT116细胞MNAT1过表达和敲低表达稳定细胞株，检测MNAT1和p53蛋白表达，分析MNAT1表达与p53半衰期的关系。<br>　　6.采用Co-IP分析HCT116细胞中MNAT1与p53或MDM2之间的相互结合；在HEK293T细胞中分别转染Flag-MNAT1和不同p53截断体HA-p53(1-300)、HA-p53(D100-300)和HA-p53(1-300)，用Co-IP和Western-blotting技术分别检测MNAT1和p53表达，分析MNAT1与p53相互作用的结构域。<br>　　7.将shMNAT1转染至HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞，构建MNAT1敲低稳定细胞株shMNAT-HCT116p53+/+和shMNAT-HCT116p53-/-，采用Western-blotting检测MNAT1、p53及p53下游靶基因p21、BAX、RAD51表达。同时检测MNAT1过表达稳定细胞株MNAT1-HCT116中p53、p21、BAX、Puma和RAD51的表达，同时检测caspase3、cleavedcaspase3、PARP和cleavedPARP表达水平，分析MNAT1对细胞凋亡的影响。<br>　　8.用阿霉素(doxorubicin, DOX)处理MNAT1过表达和敲低稳定细胞株，诱导DNA损伤应激，检测MNAT1、p53、p21、BAX、Puma、Fas和cleavedPARP表达，分析DNA损伤中MANT1表达与p53功能的关系。<br>　　9.化疗药物5-FU处理MNAT1过表达和敲低稳定细胞株，分析MNAT1对5-FU诱导细胞凋亡的影响，采用Western-blotting检测MNAT1、p53、p21、Fas和cleavedPARP表达水平，进一步明确MANT1在5-FU诱导细胞凋亡中的作用和分子机制。<br>　　10.用不同浓度梯度DOX处理HT29、DLD1、HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞，以及DOX处理细胞不同时间梯度，用Western-blotting和Real-timePCR检测MNAT1和p53的蛋白及mRNA表达水平。<br>　　11.将MNAT1敲低稳定细胞皮下注射至BALB/c裸鼠，制备裸鼠荷瘤动物模型，分析MANT1对结直肠癌细胞体内成瘤的影响。<br>　　结果：<br>　　1.免疫组化检测结果表明，MNAT1蛋白在结直肠癌组织的表达显著高于癌旁组织。MNAT1在正常结直肠组织、原发癌和转移性结直肠癌中的阳性率分别为11.3%、55.9%和56.1%。MNAT1蛋白在结肠癌组织中表达水平具有一定的诊断价值，AUC为0.933，Cutoff值为4.6，敏感性和特异性分别为87.6%和67.7%。结直肠癌患者预后分析，发现MNAT1蛋白高表达患者生存期比低表达组显著降低。<br>　　2.MTT检测和细胞克隆形成实验结果发现，MNAT1过表达显著促进体外结直肠癌细胞增殖和细胞集落形成。Transwell侵袭和迁移实验结果，发现MNAT1敲低显著抑制结直肠癌细胞侵袭和迁移。<br>　　3.在结直肠癌细胞中，基因转染上调MNAT1表达，p53蛋白表达显著降低，而p53mRNA表达水平无显著差异。<br>　　4.采用蛋白酶抑制剂MG132抑制泛素化蛋白降解，MNAT1介导的p53降低被MG132所阻断。p53泛素化检测，发现MNAT1过表达促进p53泛素化降解，MNAT1敲低显著降低p53泛素化表达，提示MNAT1可通过泛素化途径促进p53降解。<br>　　5.定量分析MNAT1过表达和MANT1敲除结直肠癌细胞p53表达，计算p53半衰期，发现MNAT1过表达缩短p53半衰期，MNAT1敲低p53延长半衰期，提示MNAT1降低p53蛋白稳定性。<br>　　6.基因转染和免疫共沉淀实验检测发现，MNAT1与p53结合。MNAT1与p53结合结构域分析发现p53氨基酸位点100-300为MNAT1结合区域。<br>　　7.MNAT1敲低可显著增加HCT116p53+/+细胞p53及其下游靶基因p21和BAX表达，而在HCT116p53-/-细胞MNAT1敲低对p21和BAX表达无显著差异。另外，在结肠直癌细胞HCT116中MNAT1敲低可抑制RAD51蛋白表达，且不依赖于p53。MNAT1过表达可显著抑制p53、p21、Puma、BAX，而上调RAD51表达。此外，在结直肠癌细胞中，MNAT1过表达显著降低cleavedcaspase3、cleavedPARP表达，细胞凋亡明显减少。<br>　　8.当细胞处于DOX诱导的DNA损伤应激反应时，MNAT1过表达能够显著抑制p53激活并且减少细胞凋亡，MNAT1敲低则促进p53激活并且增加细胞凋亡。化疗药物5-FU处理MNAT1过表达和MNAT1敲除结肠癌细胞，MNAT1敲除细胞细胞凋亡显著增加，且伴p53表达增加；而在MNAT1过表达细胞，细胞凋亡明显减少，p53表达减少。<br>　　9.DOX处理HCT116p53+/+细胞和HCT116p53-/-细胞，检测MNAT1和p53表达，结果发现在HCT116p53+/+细胞中MNAT1表达随DOX处理的时间和浓度的增加而减少，而在HCT116p53-/-细胞中MNAT1表达显著改变。<br>　　10.将MNAT1敲低的结直肠癌细胞和对照组细胞接种裸鼠小鼠，裸鼠成瘤实验发现，MNAT1敲低结直肠癌细胞的裸鼠成瘤显著小于对照组，降低MANT1表达可抑制裸鼠体内肿瘤生长。<br>　　结论：<br>　　MNAT1在结直肠癌组织中高表达，MNAT1表达与结直肠癌发生发展密切相关；MNAT1表达水平对结直肠癌的预后评价有一定的参考价值，MNAT1高表达结直肠癌患者生存期较MNAT1低表达患者生存期短。MNAT1与p53结合介导p53泛素化降解，降低p53生物学功能，抑制细胞凋亡促进细胞增殖；MNAT1促进结直肠癌侵袭和迁移。MNAT1过表达抑制5-FU诱导结直肠癌细胞凋亡。