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摘要研究背景<br>　　三氯乙烯(trichloroethylene，TCE)是一种卤代烃类有机溶剂，在工业上广泛用作金属清洗剂和溶脂剂等。在中国，每年至少有2万名新工人受到TCE暴露的威胁。工人可通过皮肤和呼吸系统接触三氯乙烯感染职业性三氯乙烯药疹样皮炎(occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene，ODMLT)，引起多器官的免疫性损伤。该病病情凶险，病死率较高，临床表现除皮肤损害、发热、肝脏损害和浅表淋巴结肿大外，肾脏损害也是其重要临床表现之一,肾功能衰竭是导致ODMLT患者死亡的主要原因之一，研究TCE致免疫肾损伤的分子机制对于预防和治疗ODMLT具有重要意义。<br>　　ODMLT通常被认为是抗原特异性T淋巴细胞介导的Ⅳ型变态反应。然而，近年来越来越多的研究表明，仅用Ⅳ型变态反应不能完全解释ODMLT的发病机理，尤其是其引起多脏器严重损伤的机制。临床和动物实验研究发现，补体系统在TCE致敏诱导的多器官免疫性损伤中也发挥了重要的作用。补体系统主要通过经典激活途径(Classical pathway, CP)，凝集素活化途径(Lectin pathway, LP)，和旁路激活途径(alternative pathway, AP)三个途径被激活，这些途径均导致中心组分补体C3裂解成生物活性片段C3a和C3b。本课题组前期研究发现，TCE经皮致敏小鼠后其肾脏肾小球中补体C3的沉积量明显增加，提示TCE致敏后肾脏局部产生的补体被激活。那么，TCE致敏后肾脏局部补体系统的激活是否介导肾脏的免疫损伤？其作用的具体分子机制是什么？大量研究证实，补体激活与内皮素-1(endothelin-1，ET-1)信号系统相关，补体系统和内皮素系统的同时活化在许多实验模型和临床病例中都有报道。而内皮素-1是肾脏损伤的标志，不仅可以作为重要的促炎症因子，诱导TNF-α、IL-1β、ICAM-1等炎性细胞因子的分泌，导致肾脏的炎症损伤；同时，内皮素-1可以通过与主要在肾脏内皮细胞上表达的内皮素B型受体(Endothelin type B receptor, ETBR)结合，介导内皮型一氧化合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)系统功能受损，减少NO的合成，引起ET-1/NO动态平衡失调，导致内皮细胞功能障碍，进而加重肾脏损伤。因此我们推测，TCE致敏引起的肾脏局部补体的激活，可通过进一步活化内皮素系统介导肾脏的炎症反应和肾脏内皮细胞功能障碍，进而导致肾脏的免疫损伤。<br>　　研究目的<br>　　建立TCE经皮致敏小鼠模型，分别采用拮抗补体激活的CatLi，及ETBR的特异性抑制剂BQ-788对TCE致敏小鼠进行预处理，探讨TCE致敏后肾脏局部补体的激活通过内皮素系统介导肾脏免疫性损伤的具体分子机制。本项目的研究结果将进一步丰富TCE致敏引起的免疫性肾损伤的复杂作用机理，为防治ODMLT免疫性多器官损伤提供理论依据。<br>　　第一部分肾足细胞内补体激活促进内皮素分泌和炎症反应介导三氯乙烯致免疫性肾损伤<br>　　研究方法<br>　　建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠模型，使用能拮抗补体激活的CatLi进行预处理，采用免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)和免疫荧光(Immunofluore-scence，IF)法检测各组小鼠肾组织中C3、C3a的表达和组织定位，分别采用检测试剂盒和苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)检测各组小鼠肾功能和肾组织病理学改变，分别采用RT-PCR、IHC、ELISA法检测小鼠肾组织中ET-1的mRNA和蛋白表达，IHC法检测各组肾组织中TNF-α，IL-1β，ICAM-1等炎症细胞因子的表达情况，并采用Westernblot法检测各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38MAPK炎症信号通路的蛋白表达水平，探讨TCE致敏后肾脏局部补体的激活通过促进ET-1分泌及其相关炎症因子的释放，介导肾脏免疫性损伤的分子机制。<br>　　结果<br>　　1.各组小鼠致敏情况<br>　　空白对照组和溶剂对照组小鼠分别5只，其背部皮肤都没有水肿和红斑，致敏评分都为0，致敏率均为0.00%；TCE处理组小鼠共20只，其中有8只小鼠致敏评分≥1，12只小鼠致敏评分为0，致敏率为40.00%；TCE+CatLi联合处理组小鼠共20只，其中7只小鼠致敏评分≥1，13只小鼠致敏评分为0，致敏率为35.00%。<br>　　2.各组小鼠肾组织中补体C3、C3a的沉积<br>　　IHC法检测补体C3和C3a在小鼠肾组织中的沉积情况。检测结果显示，空白对照组、溶剂对照组以及TCE未致敏组、TCE+CatLi未致敏组小鼠肾组织中无明显C3和C3a沉积；与溶剂对照组相比，补体C3和C3a在TCE致敏小鼠肾组织的沉积量显著增加(P<0.05)，且主要在肾小球中表达。经CatLi预处理后，TCE+CatLi致敏组小鼠肾组织中C3和C3a的沉积量较TCE致敏组明显减少(P<0.05)。这些数据表明，TCE致敏小鼠肾小球中的补体系统被激活，而CatLi能有效抑制肾脏中补体系统的活化。<br>　　3.各组小鼠肾组织中补体C3、C3a的定位<br>　　免疫荧光双染色法检测肾脏中C3(C3a)和Nephrin(肾足细胞标志蛋白)的共定位。空白对照组小鼠肾小球中未见明显C3和C3a沉积；而在TCE致敏组小鼠肾小球中，Nephrin表达阳性的足细胞中可以检测到大量C3和C3a。结果表明，TCE致敏小鼠肾脏补体的激活主要定位于肾小球足细胞。<br>　　4.各组小鼠的肾功能检测<br>　　血清Cr和BUN是反映肾功能的检测指标。检测结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组肾功能无显著差异(P>0.05)；与溶剂对照组相比，TCE致敏组小鼠血清Cr和BUN水平显著升高(P<0.05)；经CatLi预处理后，TCE+CatLi致敏组小鼠血清Cr和BUN水平较溶剂对照组虽有所升高，但与TCE致敏组相比明显下降(P<0.05)。结果说明，TCE致敏后出现肾功能损伤，而CatLi通过拮抗肾足细胞内补体的活化，改善了TCE致敏小鼠损伤的肾功能。<br>　　血清Cys-C和尿微量白蛋白/肌酐(Albumin-creatinin ration，ACR)水平反映肾小球滤过功能。检测结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组间肾小球滤过功能无显著差异(P>0.05)；与溶剂对照组相比，TCE致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平显著升高(P<0.05)；经CatLi预处理后，TCE+CatLi致敏组血清Cys-C和尿ACR水平与TCE致敏组相比显著下降(P<0.05)。结果表明，TCE致敏后小鼠肾脏肾小球滤过功能受损，而CatLi通过拮抗足细胞内补体的活化，改善了TCE致敏小鼠受损的肾小球滤过功能。<br>　　5.各组小鼠肾脏病理学检测<br>　　采用HE染色检测各组小鼠肾脏病理损伤情况。病理检查发现，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组小鼠肾组织结构清晰、正常；TCE致敏组小鼠肾组织可见明显的炎性细胞浸润、细胞肿胀，可见空泡样病变和肾小球肥大；TCE+CatLi致敏组小鼠肾组织病理损伤程度与TCE致敏组相比明显减轻，肾小球大小甚至恢复正常。<br>　　6.各组小鼠肾组织中ET-1的mRNA和蛋白表达<br>　　首先采用实时定量PCR法检测各组小鼠肾组织中ET-1的mRNA水平。检测结果显示，肾组织中ET-1的mRNA水平在空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组、TCE+CatLi未致敏组间无显著差异(P>0.05)；TCE致敏组小鼠肾组织中ET-1的mRNA水平显著升高(P<0.05)；CatLi预处理后，TCE+CatLi致敏组肾组织中ET-1mRNA水平与TCE致敏组相比明显降低(P<0.05)。<br>　　采用IHC、ELISA法检测各组小鼠肾组织中ET-1的蛋白水平。IHC染色显示，空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组小鼠肾组织中ET-1的蛋白沉积均较少，且无显著性差异(P>0.05)；而TCE致敏组肾组织中ET-1的蛋白沉积量明显增多(P<0.05)；经CatLi预处理后，TCE+CatLi致敏组肾组织中ET-1的蛋白沉积量较TCE致敏组明显减少(P<0.05)。ELISA结果也显示，小鼠肾组织中ET-1含量在空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组间无显著差异(P>0.05)；与溶剂对照组相比，TCE致敏组肾组织中ET-1含量显著升高(P<0.05)；经CatLi预处理后，TCE+CatLi致敏组小鼠肾组织中ET-1含量明显降低(P<0.05)。<br>　　7.各组小鼠肾组织中炎性细胞因子的表达<br>　　7.1各组小鼠肾组织中TNF-α的沉积<br>　　IHC检测结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组小鼠肾组织中TNF-α的蛋白沉积较少，且差异无统计学意义(P>0.05)；而TCE致敏组小鼠肾组织中可见TNF-α的蛋白沉积量显著增多(P<0.05)；尽管TCE+CatLi致敏组肾组织中TNF-α的蛋白沉积量较溶剂对照组也有所增多(P<0.05)，但与TCE致敏组相比，其肾组织中TNF-α的蛋白沉积量显著减少(P<0.05)。<br>　　7.2各组小鼠肾组织中IL-1β的沉积<br>　　IHC染色显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组小鼠肾组织IL-1β蛋白沉积较少，且无显著差异(P>0.05)；TCE致敏组肾组织中IL-1β的蛋白沉积显著增多(P<0.05)；而经CatLi预处理后，IL-1β在TCE+CatLi致敏组小鼠肾组织中的蛋白沉积量较TCE致敏组明显减少(P<0.05)。<br>　　7.3各组小鼠肾组织中ICAM-1的沉积<br>　　IHC染色显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+CatLi未致敏组小鼠肾组织中ICAM-1的蛋白沉积较少，且差异无统计学意义(P>0.05)；TCE致敏组肾组织中ICAM-1的沉积量显著增多(P<0.05)；而与TCE致敏组相比，TCE+CatLi致敏组肾组织中ICAM-1的蛋白沉积量明显减少(P<0.05)。<br>　　8.各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38MAPK信号通路蛋白表达水平<br>　　Westernblot法检测各组小鼠肾组织中NF-κBp65和p38MAPK信号通路蛋白的表达水平。结果显示，p38和p65的蛋白表达量在所有处理组之间均无显著差异(P>0.05)。其磷酸化蛋白P-p38和P-p65的蛋白表达在空白对照组和溶剂对照组间也无显著差异(P>0.05)；而P-p38和P-p65在TCE致敏组肾组织中表达显著升高(P<0.05)；经CatLi预处理后，TCE+CatLi致敏组肾组织中P-p65和P-p38的蛋白表达量与TCE致敏组相比明显下降(P<0.05)。结果表明，CatLi通过拮抗肾足细胞内补体的活化，显著下调了NF-κBp65和p38MAPK信号的表达，NF-κBp65和p38MAPK通路参与了足细胞内补体激活介导的TCE致免疫肾损伤的过程。<br>　　结论<br>　　1.TCE致敏后其肾组织中补体C3和C3a表达显著升高，且主要沉积在足细胞，表明TCE致敏小鼠肾脏足细胞内的补体系统被活化；<br>　　2.TCE致敏后肾足细胞内补体的激活上调了肾组织中ET-1的mRNA和蛋白表达，肾脏的ET-1系统被活化；<br>　　3.上调的ET-1作为促炎因子，促进了TNF-α，IL-1β，ICAM-1等炎性细胞因子的释放，导致肾脏的炎性损伤；<br>　　4.p38MAPK和NF-κBp65炎症信号通路蛋白在TCE致敏小鼠肾脏中的表达显著增多，而CatLi预处理能明显降低其表达，表明p38MAPK和NF-κBp65信号通路参与了足细胞补体激活介导的肾脏炎症损伤的作用过程。<br>　　第二部分内皮素系统通过ETBR介导肾脏内皮细胞功能障碍加重三氯乙烯致免疫性肾损伤<br>　　研究方法<br>　　建立TCE经皮致敏BALB/c小鼠模型，使用ETBR的特异性抑制剂BQ-788进行预处理，分别采用检测试剂盒和苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)检测各组小鼠肾功能及肾脏组织病理学改变；采用IHC法检测各组小鼠肾组织中血管内皮细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、细胞间黏附分子(Intercellular adhesion molecules 1，ICAM-1)的表达水平，比较各组小鼠肾脏内皮细胞功能损害情况；采用试剂盒法检测各组小鼠肾组织中一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase，NOS)的活力；采用RT-PCR和IHC法检测各组小鼠肾组织中内皮型一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的mRNA和蛋白表达情况；采用试剂盒法检测各组小鼠肾组织中一氧化氮(Nitric oxide，NO)水平，探讨TCE致敏后肾组织中内皮素系统通过ETBR介导肾脏的免疫性损伤的作用机制。<br>　　结果<br>　　1.各组小鼠经皮致敏情况<br>　　空白对照组和溶剂对照组小鼠分别5只，其背部皮肤均无水肿和红斑症状，致敏评分都为0，致敏率均为0.00%；TCE处理组小鼠共18只，其中有7只小鼠致敏评分≥1，11小鼠致敏评分为0，致敏率为38.89%；TCE+BQ-788联合处理组小鼠共18只，其中6只小鼠致敏评分≥1，12只小鼠致敏评分为0，致敏率为33.33%。<br>　　2.各组小鼠肾组织中ET-1的mRNA和蛋白的表达<br>　　分别采用RT-PCR、ELISA法检测各组小鼠肾组织中ET-1的mRNA和蛋白表达。RT-PCR检测结果显示，肾组织中ET-1的mRNA水平在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组间无显著差异(P>0.05)；而TCE致敏组小鼠肾组织中ET-1的mRNA水平与溶剂对照组相比显著升高(P<0.05)。ELISA检测结果显示，空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组肾组织中ET-1含量无显著性差异(P>0.05)；而TCE致敏组小鼠肾组织ET-1含量显著升高(P<0.05)。结果表明，TCE致敏小鼠肾组织中ET-1的mRNA和蛋白表达均显著升高，肾脏的内皮素系统被活化，与研究一结果一致。<br>　　3.各组小鼠肾功能检测<br>　　血清Cr和BUN水平是反映肾功能的检测指标，检测结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾功能无显著差异(P>0.05)；而TCE致敏组血清Cr和BUN水平与溶剂对照组相比显著升高(P<0.05)；经BQ-788预处理后，TCE+BQ-788致敏组小鼠血清Cr和BUN水平虽较溶剂对照组也有所升高，但与TCE致敏组相比显著下降(P<0.05)。血清Cys-C和尿微量白蛋白/肌酐(ACR)水平反映肾小球滤过功能。检测结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组间肾小球滤过功能无显著差异(P>0.05)；TCE致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平显著升高(P<0.05)；经BQ-788预处理后，TCE+BQ-788致敏组小鼠血清Cys-C和尿ACR水平明显降低(P<0.05)。这些结果表明，TCE致敏后小鼠肾功能和肾小球滤过功能受损，而BQ-788通过拮抗ETBR，改善了内皮素系统活化介导的TCE致小鼠肾功能和肾小球滤过功能损伤。<br>　　4.各组小鼠肾脏组织病理学检测<br>　　采用HE染色检测各组小鼠肾组织病理损伤情况。病理检查发现，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾脏组织结构清晰无异常，无炎性细胞浸润，病理学无明显改变；而TCE致敏组小鼠肾脏可见明显的炎性细胞浸润，肾小球肿大，肾脏细胞发生空泡样病变；TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织炎性细胞浸润情况明显减轻，肾小球肿大情况明显改善，细胞的空泡样病变情况明显减少，病理损伤较TCE致敏组明显减轻。<br>　　5.ETBR在肾组织中的定位<br>　　采用免疫荧光双标法检测TCE致敏组小鼠肾组织ETBR和CD31(内皮细胞标志蛋白)的共定位。结果显示，ETBR主要在肾脏内皮细胞上表达。<br>　　6.各组小鼠肾脏内皮细胞损伤情况<br>　　6.1RT-PCR法检测各组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的mRNA表达<br>　　结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)；与溶剂对照组相比，TCE致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的mRNA表达均显著升高(P<0.05)；而经BQ-788预处理后，TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的mRNA表达水平较TCE致敏组均明显下降(P<0.05)。<br>　　6.2免疫组化染色法检测各组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的沉积<br>　　结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中VCAM-1、ICAM-1的蛋白沉积很少，且无显著差异(P>0.05)；TCE致敏组肾组织中VCAM-1、ICAM-1的蛋白沉积量显著增多(P<0.05)；而经BQ-788预处理后，VCAM-1、ICAM-1在TCE+BQ-788致敏组肾组织中的蛋白沉积量明显减少(P<0.05)。结果表明，TCE致敏小鼠肾脏内皮细胞发生功能障碍或损伤，而BQ-788通过拮抗ETBR有效改善了内皮素系统介导的肾脏内皮细胞功能障碍。<br>　　7.各组小鼠肾组织中一氧化氮合酶(NOS)活力<br>　　采用NOS检测试剂盒检测各组小鼠肾组织中NOS活力。结果显示，空白对照组、溶剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组小鼠肾组织中的NOS活力无显著差异(P>0.05)；但与溶剂对照组相比，TCE致敏组小鼠肾组织中NOS活力明显降低(P<0.05)；经BQ-788预处理，TCE+BQ-788致敏组小鼠肾组织NOS活力较TCE致敏组明显升高(P<0.05)。<br>　　8.各组小鼠肾组织中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA和蛋白表达<br>　　本实验采用RT-PCR和免疫组化法检测各组小鼠肾组织中eNOS的mRNA和蛋白表达。结果显示，肾组织中eNOS的mRNA和蛋白水平在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组和TCE+BQ-788未致敏组间差异无统计学意义(P>0.05)；与溶剂对照组相比，TCE致敏组肾组织中eNOS的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；虽然TCE+BQ-788致敏组肾组织中eNOS的mRNA和蛋白表达水平较溶剂对照组也有所降低(P<0.05)，但与TCE致敏组相比，其肾组织中eNOS的mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。<br>　　9.各组小鼠肾组织中NO水平<br>　　采用NO检测试剂盒检测各组小鼠肾组织中NO含量。结果显示，小鼠肾组织中NO含量在空白对照组、试剂对照组、TCE未致敏组、TCE+BQ-788未致敏组间无显著差异(P>0.05)；而TCE致敏组小鼠肾组织中NO含量显著降低(P<0.05)；经BQ-788预处理后，TCE+BQ-788致敏组肾组织中NO含量明显升高(P<0.05)。<br>　　结论<br>　　1.TCE致敏后，肾组织中ET-1含量和mRNA表达量显著升高，肾脏内皮素系统被活化；<br>　　2.肾脏内皮素系统通过与内皮细胞表面ETBR结合，抑制肾组织中NOS的活力，降低eNOS的mRNA和蛋白表达，减少NO的合成和释放，造成NO/ET-1动态平衡失调，介导肾脏内皮细胞功能障碍，进而加重TCE致免疫性肾损伤。<br>　　3.BQ-788通过抑制ETBR，可有效减轻内皮素系统介导的肾脏内皮细胞功能障碍，改善了TCE致敏小鼠的免疫性肾损伤。