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摘要实验目的<br>　　糖尿病足溃疡是糖尿病常见的并发症之一，其潜在机制很复杂。患者最终多选择截肢手术，因此它严重影响患者的生活质量。目前，许多研究表明内皮功能障碍可能是其发生发展的主要因素，但确切的病理机制尚不明确。本实验主要研究糖尿病足溃疡发展过程中高糖对血管内皮细胞的损伤及可能的分子机制。<br>　　研究方法<br>　　使用临床糖尿病足溃疡患者病变部位的组织进行病理分析，采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模拟高糖环境，进一步探讨其可能的分子机制。具体实验步骤如下：<br>　　1.通过苏木精-伊红(H&E)染色、马森三色染色和过碘酸希夫反应(PAS)对糖尿病足溃疡中心组织、溃疡边缘相对正常组织和正常对照组织进行组织形态学分析；<br>　　2.通过检测糖尿病足溃疡中心组织与溃疡边缘组织中SOD、CAT、GSH-Px和MDA等指标，观察氧化应激在糖尿病足溃疡形成中的作用；<br>　　3.通过WesternBlot实验及定量分析研究PKCβ/p66Shc轴对eNOS、ICAM-1和NF-κB表达的影响及在糖尿病足溃疡形成中的作用；<br>　　4.通过CCK-8检测高糖对HUVEC增殖的影响，进行形态学分析并选取合适的高糖浓度行ROS检测，进一步使用PKCβ抑制剂观察高糖对ROS的作用是否受抑制剂的影响；<br>　　5.使用HUVEC于体外模拟高糖环境的条件下，观察SOD、CAT、GSH-Px和MDA等指标较对照组的变化情况，并在此基础上加入PKCβ抑制剂探究其对上述指标的影响；<br>　　6.通过WesternBlot和免疫荧光(IF)及定量分析，检测PKCβ/p66Shc轴在高糖HUVEC环境下对eNOS、ICAM-1和NF-κB表达的影响。<br>　　研究结果<br>　　1.糖尿病足溃疡中心组织的结构紊乱，血管环稀少，细胞核呈多形态，聚集或位于细胞的边缘。边缘组织的葡萄糖代谢升高；<br>　　2.糖尿病足溃疡中心组织与溃疡边缘组织相比，SOD，CAT，GSH-Px的活性明显下降，而MDA的含量明显增加；<br>　　3.相对于溃疡边缘组织，溃疡中心组织中PKCβ、p66Shc和NF-κB的磷酸化明显升高，ICAM-1的蛋白表达升高而eNOS的表达明显降低；<br>　　4.随着培养基中葡萄糖浓度的增加(0、10、20 mM)，HUVEC中的ROS水平相应地增加，在应用PKCβ抑制剂后明显降低；<br>　　5.PKCβ抑制剂可提高高糖诱导的HUVEC中SOD，CAT，GSH-Px的活性，降低了MDA的含量。<br>　　6.PKCβ抑制剂可降低高糖诱导的HUVEC中PKCβ、p66Shc、NF-κB的磷酸化，下调ICAM-1的蛋白表达并增加eNOS的表达。<br>　　研究结论<br>　　高糖通过增加PKCβ-p66Shc的表达，引起糖尿病足溃疡组织中NF-kB的磷酸化和ICAM-1的表达增加，降低eNOS的生成。PKCβ抑制剂LY333531阻断了高糖HUVEC细胞中PKCβ-p66Shc这一途径，提高eNOS的表达，降低了ROS对内皮细胞的损伤，提示抑制PKCβ蛋白表达可抑制细胞氧化应激损伤和血管内皮损伤，从而预防和治疗糖尿病足溃疡。